肝细胞肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,在全世界癌症死亡中排第三位。大约占所有原发性肝癌病例的70%-80%。肝癌的放射治疗、外科手术治疗、化学治疗和肝脏移植等方法是目前治疗HCC常用的,但大多数患者确诊时已发展至癌症晚期,且患者体质较差,故大部分患者只适合保守疗法,治疗肝癌仍具有很大的挑战性。现在的一些研究开始关注HCC的免疫治疗。在大多数情况下,自身免疫调节有助于肿瘤的缓解,这说明免疫系统在控制肝癌的发生发展中占有重要作用。调节性B细胞(Bregs)主要是通过生成抑制性细胞因子来协调免疫系统和维持B细胞的抑制作用。Bregs已被证明可通过对自身反应性T细胞抑制自身免疫,也可以直接抑制细胞毒性T淋巴细胞活性减弱抗肿瘤免疫。越来越多的证据表明Bregs在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。虽然Bregs已被证明在肿瘤的发生发展中具有至关重要的作用,但在肿瘤发生发展过程中诱导Bregs生成的肿瘤微环境因素或细胞因子仍然不明了。B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是TNF家族细胞因子的一员,对调节B淋巴细胞的成熟和功能至关重要。早期文献表明,BAFF被普遍认为是炎症促进因子,BAFF可诱导边缘带B细胞(MZ B细胞)分化成可分泌IL-10的调节性B细胞。文献表明BAFF在调节B淋巴细胞的成熟和功能中扮演着双重角色。在本课题中我们将探讨Bregs及其分化增殖密切相关的细胞因子在HCC发生发展中重要作用。白芍总苷(TGP)是从传统中药芍药根部提取出的有效部位,没有明显的毒性或副作用。TGP中包含芍药苷、芍药花苷、苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷,芍药苷是其主要活性物质。TGP具有抗炎镇痛免疫调节等作用,治疗肝脏疾病和类风湿关节炎效果明显。其对SMMC-7721和HepG2细胞增殖的抑制作用早已被我们实验室证实。这些发现为TGP能否抑制肝癌的免疫逃逸从理论上提供了有价值的线索。在本课题中我们将研究Bregs及其相关细胞因子在肝癌的发生发展中的动态变化,TGP能否通过影响Bregs及其相关细胞因子治疗DEN诱导的实验性肝癌。目的：1.部分阐明HCC发生发展中Bregs及其相关细胞因子的动态变化；2.明确TGP对大鼠HCC的治疗作用及部分机制。方法：1建立DEN诱导大鼠HCC模型,SD大鼠随机分为正常组、模型组和TGP组(30、60、120 mg·kg-1),共5组。模型组、TGP组大鼠灌胃给予DEN造模,于每天上午灌胃(0.1% DEN 8 mg/kg/次,每周6天,每天1次),同时给予正常组相同量的生理盐水,共16周。在第12周开始,分别灌胃TGP(30、60、120mg·kg-1),每天1次,连续4周,正常组和模型组给予等量的5%CMC-Na。分别于造模的第4周,第12周和第16周称重后采用股动脉取血的方法处死大鼠。无菌操作取出各组大鼠脾脏和肝脏,分别称重,并记录大鼠肝脏和脾脏的重量计算肝脾指数。量取并记录肝脏表面的肿瘤体积以及结节的数量；采用检测试剂盒检测各实验组大鼠血清中ALT、AST、ALP、AFP、BAFF、IL-4、IL-7和IL-10的水平变化；各组大鼠肝脏的组织病理学检查使用HE染色法进行观察；流式细胞术检测大鼠外周血中Bregs表达比例。Western-blot法检测大鼠脾脏中B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物(TACI)和B细胞活化因子受体(BAFF-R)表达水平的变化。2体外培养正常大鼠脾脏淋巴细胞,加入不同浓度的BAFF刺激,并观察Pae作用。采用流式细胞术法检测Bregs的比例,使用ELISA检测上清中IL-10的水平。结果：1.TGP对DEN诱导大鼠HCC的治疗作用1.1 TGP对HCC大鼠肝脾指数、肿瘤体积、肿瘤结节数以及死亡率的作用与正常组对比,模型组大鼠死亡率明显升高,肝脏和脾脏指数也有显著上升、肝脏肿瘤结节体积明显变大结节数明显上升。与模型组比较,iTGP(60、120 mg·kg-1)能显著降低HCC大鼠升高的肝脾指数,减少肝表面结节数和减小肿瘤结节体积。且大鼠死亡率也明显降低。1.2 TGP对DEN诱导HCC大鼠的肝脏组织病理学影响正常组大鼠有着完整清晰的肝小叶构造肝且表面光滑有光泽,肝索排列很整齐,细胞核清晰。经过DEN诱导16周后,肝脏表面粗糙不平,出现大小不等的结节,癌肿形成,出现结构紊乱的肝小叶,发生炎性细胞浸润,同时大量假小叶出现,HCC细胞呈现低分化,癌细胞浸润,细胞排列紊乱,异型性明显,细胞核增大,胞质减少。TGP(60、120 mg·kg-1)剂量组明显减轻炎性细胞发生浸润,减少肝脏上假小叶形成和出现,同时癌细胞的异型性明显降低。1.3 TGP对DEN诱导HCC大鼠血清ALT、AST和ALP活性的作用与正常组对比,模型组大鼠血清中ALT、AST和ALP的活性明显上升。与模型组比较,TGP (30、60mg·kg-1)能显著降低血清/ALT、AST、ALP的活性。1.4 TGP对DEN诱导HCC大鼠血清AFP的作用与正常组比较,模型组大鼠血清AFP的水平明显升高。与模型组比较,TGP(30、60、120mg·kg-,)能够明显降低大鼠血清中AFP水平。1.5 TGP对DEN诱导HCC大鼠血清IL-7、IL-4和BAFF水平的作用与正常组相比肝癌模型组大鼠,随着DEN给药的进行(4w、12w、16w)大鼠血清中BAFF水平明显升高。随着肝癌病程的进展IL-7和IL-4表达无明显变化。同模型组相比,TGP(60、120 mg·kg-1)能明显降低大鼠血清中BAFF水平,TGP各剂量组对L-7、IL-4无明显影响。1.6 TGP对DEN诱导HCC大鼠外周血中IL-10水平的作用ELISA结果显示,与正常组比较,在造模第4、12和16周,模型组大鼠肝组织中IL-10水平均明显升高(p<0.01),且随着病程进展,IL-I0水平逐渐升高。同模型组相比TGP (60,120 mg·kg-)剂量组可显著降低的IL-10水平1.7 TGP对DEN诱导HCC大鼠脾脏中Bregs比例的影响与正常组相比,模型组大鼠随着DEN给药的进行(4w、12w、16w)大鼠外周血中Bregs的比例上升明显。TGP(60、120 mg·kg-1)同模型组对比能明显降低大鼠外周血中Bregs的比例。1.8TGP对DEN诱导HCC大鼠脾脏组织中BCMA、TACI和BAFF-R表达的影响与正常组相比,模型组大鼠肝组织中BCMA、TACI表达无显著变化,BAFF-R表达显著升高。与模型组相比,TGP (60、120 mg·kg-1均能显著降低脾脏组织中BAFF-R表达,TGP各剂量组对BCMA、TACI无明显影响。1.9TGP治疗后BAFF与Bregs之间的相关性分析为了探讨BAFF与Bregs在促进肿瘤发生发展中的联系,对它们做了相关性分析。结果显示模型组中升高的BAFF同脾脏中Bregs的变化成正相关。通过TGP的治疗,降低的BAFF同脾脏中的Bregs的变化也成正相关。1.10 Pae对BAFF诱导正常大鼠脾脏淋巴细胞分化为Bregs的影响同空白组比较,BAFF (20ng·ml-1)能明显升高淋巴细胞中Bregs的比例。同BAFF (20ng·ml-1)组比较,Pae (10-6mol/L)组Bregs比例明显降低。1.11 BAFF对正常大鼠脾脏淋巴细胞培养上清IL-10水平的影响与正常组比较,BAFF(20 ng/ml)组IL-10水平明显升高。同BAFF(20ng/ml)组比较,Pae (10-6mol/L) 组能明显降低BAFF升高的IL-10的水平。结论：1.HCC大鼠血清中升高的AST、ALT和ALP的活及血清中AFP水平能显著被TGP下调,肝癌大鼠肝脏肿瘤结节数及肿瘤结节体积经过TGP治疗也明显下降,TGP还能显著降低大鼠的死亡率和肝脾指数,提示TGP对DEN诱导大鼠HCC有明显治疗作用。2.TGP可下调异常升高的BAFF水平、淋巴细胞BAFF-R表达、Bregs比例和IL-10产生,可能与其治疗大鼠HCC有关。