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传统捕捞业已经难以满足未来世界对鱼类和甲壳类动物的需求,海水养殖已经进入了新的领域;虾体在养殖过程中遇到新病原的风险也将增大。对虾病原传播的原因有:对养殖对虾不规范的引入造成对虾病原的跨区域传播,以及用鲜活饵料去喂养SPF亲虾导致病原的水平传播。目前对对虾养殖业危害比较大的病原有:白斑综合征病毒(WSSV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VPAHPND)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和黄头病毒(YHV)等。对于对虾疫病的防治,主要是预防为主,体外诊断技术为疫病的监测提供了必要的保障。为了使本实验室开发的对虾病原体外诊断试剂盒能够在对虾养殖过程中,对疫病起到更好的监控作用,本研究以WSSV现场快速高灵敏检测试剂盒为研究对象,对试剂盒的相关性能进行评价和优化。本文首先针对本实验室研发的对虾白斑综合征病毒(WSSV)现场快速高灵敏检测试剂盒的相关性能进行评价。根据OIE《水生动物诊断手册》、农业部公告第683号和质检行业标准等规范性技术文件,随机挑取参试试剂盒一共157套;对抽样试剂盒的分析灵敏度(ASe)、分析特异性(ASp)、诊断灵敏度(DSe)、诊断特异性(DSp)、重复性和稳定性等进行分析和评价。该试剂盒ASe为102copies/μL,Asp结果显示该试剂盒与YHV、CMNV、HPV、VPAHPND、EHP和IHHNV等6种对虾病原及对虾组织核酸无交叉反应;与OIE标准中WSSV的套式PCR方法相比,该试剂盒测试374份临床样品的DSe为94.6%,DSp为95.8%;该试剂盒对于阴性样品及强阳性样品的检测重复率100%,弱阳性样品的检测重复率88.9%;试剂盒在-20℃保存6个月以上。所研制的对虾白斑综合征病毒现场快速高灵敏检测试剂盒与OIE标准套式PCR方法检测结果相符性高;检测时间由6—8h缩短为1.5 h;具有操作简便、快速、分析灵敏度高、分析特异性强、重复性好稳定性强等优点,适用于对虾各生长阶段样品中WSSV的高灵敏度检测、流行病学监测的样品检测以及疾病的现场诊断。在原有试剂盒的基础上,为简化试剂的操作步骤,降低现有试剂盒操作中因后期染料处理可能造成的污染风险,本文尝试在检测管反应液中直接加入染料,以进行反应的实时观测。选取HNB和Caclein/MnCl2两种染料,分别优化其在反应体系中的浓度,并进行分析灵敏度的对比。实验结果显示:当HNB的终浓度为150μM时,阴阳性结果的色差较为明显,该浓度下的分析灵敏度为102 copeis/μL;虽然Caclein/MnCl2终浓度在25/500μM时比在50/500μM的阴阳性色差稍弱一些,但前者的分析灵敏度要比后者高一个数量级,达到了102 copeis/μL。经优化的HNB和Caclein/MnCl2在分析灵敏度上和本实验室现有试剂盒的分析灵敏度保持一致,说明两种染料都可以作为现有试剂盒的备用染料。Caclein/MnCl2的阳性结果显色为荧光绿色,这与本实验室现有的试剂盒相同。Caclein/MnCl2的阴性结果显色为橙粉色,而试剂盒为橘黄色。因此,Caclein/MnCl2与现有试剂盒在颜色判读上比较接近,并且和某商品化的Caclein/MnCl2染料在扩增效率和显色程度上基本一致。筛选出的染料在成本上远远低于商品化的成套染料,所以拟将该染料用在现有试剂盒中。由于对虾发病通常不止一种病原导致,因此本文期望可以通过实验结果同时判定多种病原的感染情况。但是LAMP的扩增产物是大小不一的DNA片段,无法像多重PCR那样,通过电泳结果中不同条带的大小来判别是否发生了不同的扩增。而以染料法、pH法建立的LAMP方法也不能同时区分究竟是哪种病原引起的扩增。为了能够用LAMP方法同时检测多种病原,进一步节约时间,提高检测效率,本实验尝试进行了探针法建立多重LAMP方法。本实验基于探针原理,建立了duplex-LAMP方法,可同时检测WSSV和VPAHPND两种病原。使用LAMP的通用体系建立的duplex-LAMP方法对于WSSV和VPAHPND的分析灵敏度均为103 copies/μL。虽然本实验中duplex-LAMP的分析灵敏度没有普通LAMP的分析灵敏度高,但是也基本达到了作为分子生物学诊断技术的要求。而分析特异性结果显示该duplex-LAMP检测方法与EHP、HPV和IHHNV无交叉反应,特异性强。所以该duplex-LAMP方法仍然可以对未知样品的感染情况进行病原的快速初次筛选。此外,探针法WSSV-LAMP的分析灵敏度比duplex-LAMP方法高,说明体系中同时存在两套LAMP引物并同时进行扩增时,彼此之间的扩增效率会受到影响。