目的：应用脂肪细胞和巨噬细胞条件培养基以及饱和脂肪酸孵育骨骼肌细胞,检测胰岛素刺激的骨骼肌葡萄糖转运子4(GLUT4)的转位和胰岛素信号分子的磷酸化水平,研究肥胖和缺氧对骨骼肌胰岛素作用的影响,探讨肥胖导致周身胰岛素抵抗的机制。方法：1.脂肪细胞和巨噬细胞分别进行常氧和缺氧(1%02,5%CO2,94%N2)培养,制备条件培养基。2.用脂肪细胞和巨噬细胞的条件培养基孵育骨骼肌细胞,采用偶联抗体的吸光度分析法测定骨骼肌GLUT4转位,采用(?)Vestern Blot法测定胰岛素信号分子的磷酸化水平。3.用饱和脂肪酸棕榈酸孵育骨骼肌细胞,采用偶联抗体的吸光度分析法测定骨骼肌中GLUT4转位,采用(?)Vestern Blot法测定胰岛素信号分子的磷酸化水平。4.采用ELISA法测定脂肪细胞和巨噬细胞条件培养基内TNF-α的水平。5.采用Real-time PCR法,测定常氧和缺氧处理的脂肪细胞脂联素mRNA、 TNF-a mRNA和巨噬细胞TNF-a mRNA水平。6.采用Transwell系统观察常氧和缺氧培养的脂肪细胞对巨噬细胞的趋化作用。7.本研究的数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果：1.缺氧处理脂肪细胞和巨噬细胞,GLUT1蛋白表达增加。2.常氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞,在C2C12和L6两种骨骼肌细胞中,基础状态和胰岛素刺激状态下GLUT4转位与对照组相比无显著性差异；缺氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞骨骼肌细胞在基础状态下GLUT4转位与对照组相比有显著增加(p<0.05,p<0.01),而胰岛素刺激的GLUT4转位与对照组相比增加无显著性差异,C2C12骨骼肌细胞胰岛素刺激GLUT4转位增加的倍数与对照组相比呈下降趋势,但无显著性差异,而在L6细胞中则显著下降(p<0.05)。3.常氧处理的巨噬细胞条件培养基孵育C2C12骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态和胰岛素刺激状态下GLUT4转位有上升趋势,但无显著性差异。缺氧处理的巨噬细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态下GLUT4转位有显著性升高(p<0.05),胰岛素刺激状态下GLUT4转位有增加趋势,但无显著性差异。两组胰岛素刺激GLUT4转位增加的倍数与对照组相比均呈下降趋势,但无显著性差异。4.常氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育C2C12骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态下Akt磷酸化水平有升高的趋势,但无显著性差异,胰岛素刺激的Akt磷酸化水平与对照组相比无显著性差异。缺氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育C2C12骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态下Akt磷酸化水平有升高的趋势,但无显著性差异,胰岛素刺激的Akt磷酸化水平与对照组相比无显著性差异。5.常氧处理的巨噬细胞条件培养基孵育C2C12骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态下Akt磷酸化水平有升高的趋势,但无显著性差异,胰岛素剌激的Akt磷酸化水平与对照组相比无显著性差异。缺氧处理的巨噬细胞条件培养基孵育C2C12骨骼肌细胞,与对照组相比,基础状态下Akt磷酸化水平有升高趋势,但无显著性差异,而胰岛素刺激的Akt磷酸化水平与对照组相比无显著性差异。6.棕榈酸孵育骨骼肌细胞,可使骨骼肌细胞在基础状态下GLUT4转位和对照组相比无明显改变,而在胰岛素刺激下的GLUT4转位和对照组相比显著降低(p<0.05)。溶剂组BSA孵育的骨骼肌细胞,胰岛素增加骨骼肌细胞Akt的磷酸化水平,而棕榈酸孵育则使胰岛素刺激的Akt磷酸化水平显著性降低。胰岛素增加S6K的磷酸化水平,而棕榈酸孵育不影响胰岛素刺激的S6K的磷酸化以及IRS1$636/639磷酸化水平7.缺氧处理的脂肪细胞和巨噬细胞条件培养基中TNF-a水平显著升高(p<0.01)。8.缺氧处理的脂肪细胞脂联素mRNA水平降低(p<0.01),缺氧处理的脂肪细胞和巨噬细胞TNF-α mRNA水平显著升高(p<0.01)。9.缺氧处理的脂肪细胞吸引巨噬细胞迁移增加。结论：1.缺氧培养箱培养细胞,可造成脂肪细胞和巨噬细胞缺氧,模拟肥胖者脂肪组织缺氧,制备条件培养基。2.常氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞可造成骨骼肌细胞胰岛素刺激的GLUT4转位增加的倍数呈下降的趋势,但无显著性差异。而缺氧处理的脂肪细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞可造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗。3.常氧处理和缺氧处理的巨噬细胞条件培养基孵育骨骼肌细胞使骨骼肌细胞胰岛素刺激的GLUT4转位增加的倍数呈下降的趋势,但无显著性差异。4.饱和脂肪酸孵育可造成骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其机制可能不涉及S6K。5.脂肪细胞在缺氧状态下脂联素表达水平显著下降,TNF-α表达水平显著增加。巨噬细胞在缺氧状态下,TNF-α表达水平显著增加。这些因子可能参与条件培养基导致骨骼肌胰岛素抵抗的机制。6.脂肪细胞缺氧可吸引更多的巨噬细胞,可能参与肥胖导致周身胰岛素抵抗的机制。