微孢子虫是一类专营细胞内寄生的单细胞真核生物,具有广泛的宿主域。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)引起的家蚕微粒子病是蚕桑业中的重要病害之一,给蚕业生产带来重大损失。近年来,宿主与病原体之间相互作用的研究已成为热点,家蚕作为家蚕微孢子虫的宿主,其对微孢子虫侵染的应答反应机制的研究有助于我们深入了解家蚕应对病原入侵的策略。家蚕微孢子虫作为家蚕的病原,其侵染机制一直受到人们的广泛关注和研究,微孢子虫的发芽过程作为侵染的重要一环,对其研究具有重要意义。微孢子虫内渗透压的增加是孢子发芽的先决条件,有报道认为,微孢子虫水通道蛋白和海藻糖酶有可能是促使微孢子虫内渗透压增加的关键蛋白。因此,本论文就宿主家蚕细胞对微孢子虫侵染应答的蛋白质组学和家蚕微孢子虫海藻糖酶的功能开展研究,主要结果如下:1.基于iTRAQ技术家蚕微孢子虫侵染BmN细胞的蛋白质组学分析利用家蚕微孢子虫体外感染增值体系,以感染和未感染家蚕微孢子虫的BmN细胞为研究材料,采用iTRAQ技术对感染组(6 h、12 h、24 h、48 h、96 h和8 d)和对照组的蛋白进行同位素相对标记和绝对定量,并利用GO和KEGG富集分析对差异表达的蛋白进行功能分析。用家蚕的蛋白质组数据库(http://www.uniprot.org/proteomes/UP000005204)对原始质谱数据进行检索,共检索到33 513条多肽序列和4 872条蛋白序列,其中,有4 077个蛋白质是可信蛋白,在感染组与对照组中总的差异蛋白数为1 597种。在感染早期,有大量蛋白表现出差异表达,这表明BmN细胞在家蚕微孢子虫感染早期有一个高效的应答过程。在感染中期,差异表达蛋白的数量最大,下调蛋白的数量达到一个峰值,原因可能是由于微孢子虫的增殖分裂引起了BmN细胞的应答增强。在感染后期,差异表达蛋白的数量开始减少,可能是由于微孢子虫进入孢子形成期和BmN细胞大量死亡,BmN细胞对其应答减弱。这说明Bm N细胞应对微孢子虫的感染做出的蛋白表达调控与微孢子虫的侵染过程有一定的相关性。采用GO和KEGG富集分析来探索差异表达蛋白的生物学功能和参与的生物途径。GO分析的结果显示,有大量的差异表达蛋白参与到生物合成、翻译、蛋白质修饰和运输过程,说明家蚕微孢子虫的感染对宿主的生理和发育过程产生了很大的影响,宿主需要合成大量的氨基酸来应对病原的入侵。KEGG分析的结果显示,家蚕微孢子虫的感染激活了BmN细胞众多的与先天免疫相关的途径,例如:内吞作用(Endocytosis)、泛素-蛋白酶体(ubiquitin-proteasome)、谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism)、溶酶体(Lysosome)、过氧化物酶体(Peroxisome)、吞噬体(Phagosome)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、JAK-STAT信号通路(JAK-STAT signaling pathway)、自噬调节(Regulation of autophagy)等,说明宿主对微孢子虫侵染的应答反应是一个复杂的调控过程,宿主利用自身的免疫应答机制积极全面的应对微孢子虫的入侵。2.家蚕微孢子虫海藻糖酶的序列分析和功能初探以家蚕微孢子虫为研究材料,基于微孢子虫数据库,利用分子生物学的技术和手段,对家蚕微孢子虫海藻糖酶进行了生物信息学分析和功能的初探。在微孢子虫基因组数据库检索发现的家蚕微孢子虫海藻糖酶具有4个基因拷贝,通过对4个基因拷贝编码氨基酸序列与其它微孢子虫同源氨基酸序列的比对和进化树分析发现,家蚕微孢子虫海藻糖酶与其它微孢子虫海藻糖酶的氨基酸序列相似度较低。选取其中一个比较保守的序列(NbTre1)作进一步分析,NbTre1没有信号肽结构,亚细胞定位预测位于细胞质中,其14个磷酸化位点中有11个是丝氨酸和苏氨酸位点,推测NbTre1可能通过翻译后的磷酸化和去磷酸化修饰来改变自身的活力。同时,NbTre1磷酸化和去磷酸化的反应也可能在一定程度上参与细胞信号传导,调节海藻糖的降解。通过构建重组表达载体pET28a-NbTre1并转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得NbTre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合NbTre1蛋白。纯化的融合NbTre1蛋白质分子质量大小与预期结果一致,经亲和层析后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体效价达1?25600,通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,提示制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。通过实时荧光定量PCR检测NbTre1基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后不同时期的表达水平,显示该基因在感染宿主过程中具有转录活性,而且感染初期具有较高的表达水平,说明该基因有可能参与到家蚕微孢子虫的发芽过程,该基因表达的海藻糖酶有可能是微孢子虫发芽的关键蛋白。利用制备的多克隆抗体通过间接免疫荧光技术对NbTre1在微孢子中的定位情况进行了分析,结果NbTre1蛋白在孢子内部有分布,但具体的定位信息还有待于进一步研究。本论文研究结果为我们深入了解家蚕对微孢子虫侵染的应答反应及其相互作用做了铺垫,对NbTre1的序列和转录特征以及定位有了初步了解,为进一步研究其功能奠定了基础。