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有关创面愈合的研究仍然是医学界的重大课题。各种创伤、烧伤等造成的体表皮肤缺损不仅产生局部的渗出、感染和疼痛,严重者还可能导致全身感染、水电紊乱、休克甚至危及生命,延迟愈合的创面还易形成增生性瘢痕。如何加快创面上皮化的速度、促进表皮细胞的早期覆盖是实现创面良好愈合的重要目标。表皮干细胞（epidermal stem cell, ESC）是皮肤组织再生和创伤修复的关键。它不仅维持表皮的日常新陈代谢,而且在创伤后可分化发育不断产生新的表皮细胞,从创缘或残留的表皮细胞岛向创面中心增殖分化以覆盖创面而实现创面的上皮化和修复,它的增殖、分化、迁移等行为受到体内多种因素的影响,但其调控机制目前仍不甚清楚。某些细胞因子,如表皮生长因子、角质形成细胞因子及间质细胞衍生因子1（SDF-1）等,可刺激ESC的增殖及分化。细胞表面的粘附斑蛋白,可对多个细胞因子效应进行汇聚整合后通过招募Rac1蛋白,启动细胞分化、迁移等一系列细胞行为。我们推测,Rac1蛋白在ESC功能调控中可能扮演关键角色,将其作为促进创面愈合进程的靶标,可能取得更好的效果。Rac蛋白是属于Ras超家族Rho亚家族的一类小分子量GTPase,具有结合和水解GTP核苷酸的能力,从而使蛋白在具有活性的GTP结合形式和无活性的GDP形式之间进行转换,通过激活不同的效应分子发挥不同的作用。Rac1蛋白是细胞骨架调节的关键蛋白,对于细胞的层形伪足形成和方向性运动具有中心调节作用。Benitah等人研究发现Rac1蛋白缺失可导致皮肤干细胞的耗竭,毛囊和部分皮肤形成障碍,提示了Rac1蛋白与ESC发育具有相关性。究竟Rac1对ESC的调控作用如何,在创伤情况下,Rac1蛋白与ESC的关系又如何,这些问题成为我们研究的焦点。目的:分析Rac1蛋白、ESC及创面愈合三者的相关性,探讨Rac1蛋白在创伤后对ESC的调控作用以及它们参与创面愈合的机理,为进一步完善创面愈合的基础理论以及指导临床应用打下基础。方法:Rac1蛋白属于G蛋白家族,通过氨基酸的点突变可以使其停留在失活或活化状态,从而达到研究蛋白功能的目的。因此,在本研究中,我们选择IV型胶原快速黏附法在体外分离培养ESC,并采用慢病毒转染的方法在ESC中高表达Rac1蛋白的活化型或者抑制型突变体,观察突变体蛋白表达对于ESC增殖、迁移及分化等各项功能的影响,最后利用三维皮肤模型观察ESC中Rac1蛋白表达变化对于表皮再生的影响。结果:1.采用IV型胶原快速黏附法对ESC进行体外分离培养,所得细胞呈典型的“铺路石样”和克隆性生长,克隆形成能力高,细胞表面有ESC的特异性标志物表达(α6bri CD71dim,β1bri),说明ESC分离培养成功。2.酶切和测序证实包含Rac1突变体基因片段的慢病毒载体构建成功,磷酸钙共沉淀法制备的慢病毒可有效感染ESC,FACS检测感染效率均在90%以上,共聚焦显微镜可在ESC胞浆中观察到弥散表达的Rac1突变体蛋白,细胞形态无明显变化。3. MTT法检测ESC增殖发现Rac1蛋白功能与ESC生长呈正性相关。4.表达不同Rac1突变体蛋白的ESC,在G0/G1、S或G2/M期的细胞比例均无统计学差异。5. ESC在I型胶原、IV型胶原、纤连蛋白上的粘附细胞比例及ESC表面粘附分子α6与β1整合素的水平均随Rac1蛋白功能的改变而改变,其中在I型胶原上的变化显著高于其他基质。6.激光共聚焦显微镜观察ESC的细胞骨架,表达活化型突变体的ESC面积较对照组明显增大,细胞呈多角形,较为伸展,在细胞边缘可见层板状伪足伸出;表达抑制型突变体的ESC面积明显缩小,细胞呈小圆形,少见伪足伸出。说明ESC的延展能力受到Rac1蛋白的正相关性调节。7.在趋化因子SDF-1作用情况下,上调Rac1蛋白功能对ESC的Transwell迁移的促进率达56.7%,下调蛋白功能的抑制率达78%,显著高于普通培养基作用下ESC迁移水平的变化。说明Rac1蛋白在应激状态下可能发挥更重要的调节作用。8.划痕实验中,下调Rac1蛋白功能可显著抑制单层ESC对创面的愈合水平。9.下调Rac1蛋白功能可显著抑制ESC的克隆形成能力,促进细胞分化。10. HE染色观察三维皮肤模型的结构,与对照组相比,表达活化型Rac1突变体蛋白的ESC生成的表皮组织明显增厚,细胞数量多,组织结构清晰,更加接近正常皮肤形态,表达抑制型Rac1突变体蛋白的ESC生成的表皮组织则明显变薄,增生较差。说明Rac1蛋白对ESC的表皮重建功能具有正相关性调控作用。结论:1.使用IV型胶原快速黏附法可成功在体外对ESC进行分离培养,采用慢病毒转染的方法可在ESC中获得稳定高效的蛋白表达。2.由于在不同Rac1突变体作用的情况下,ESC的粘附、分化及克隆形成能力变化与ESC迁出干细胞小室时的变化相一致,证明Rac1蛋白可能通过控制ESC从干细胞小室中的迁出过程来帮助决定干细胞的命运。3. Rac1蛋白对ESC的增殖和迁移具有正相关性调节作用,对ESC的分化具有负相关性调节作用。增殖、迁移和分化是ESC愈合创面所需的基本功能,Rac1蛋白可通过调控ESC的这些功能而在皮肤创面愈合进程中发挥作用。4.在三维皮肤模型上,源于ESC的表皮再生受到Rac1蛋白的正相关性调节,Rac1蛋白可通过调节表皮再生而参与皮肤创面愈合进程。