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人胰葡萄糖激酶（PGK）具有调节肝脏中葡萄糖代谢和刺激胰腺β细胞分泌胰岛素的双重作用,是治疗Ⅱ型糖尿病（DM）研究的一个重要新型靶点。基于该靶点筛选得到的葡萄糖激酶激动剂（GKAs）可能对DM治疗具有应用前景,已成为药学领域的研究热点。近几年,国内外研究人员采用的体外筛选平台往往使用动物来源的GK,主要建立在葡萄糖激酶（GK）的酶活测定体系上,且没有对反应体系和反应条件进行优化。因此,该体系筛选得到的GKAs假阳性率高,往往浪费大量的人力和物力。综上所述,建立可靠、灵敏的体外筛选平台对新型降糖药物的研发具有重要意义。本论文在大肠杆菌（E.coli）中成功表达人PGK,并对其进行纯化,然后用该酶建立高通量的体外降糖活性因子筛选平台。主要研究内容如下:1通过聚合酶链式反应（PCR）扩增人胰葡萄糖激酶基因;以质粒6HisT-pRSET为表达载体,构建重组质粒6HisT-pRSET-PGK,转化E.coli BL21;以IPTG诱导表达目的蛋白,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白在E.coli BL21中的表达及其表达形式;2采用Ni-NTA His.Bind Resin层析纯化带有6His·Tag的重组蛋白PGK;纯化后的重组蛋白样品经SDS-PAGE和Quantity One凝胶图象处理软件分析表明其纯度为100%;采用Bradford蛋白测定法得出纯化后重组蛋白的浓度约2.07mg/mL;3采用双酶偶联酶活测定法,通过紫外可见分光光度计测定产物β-NADPH的生成量,测定纯化得到的重组蛋白PGK活性,发现PGK的比活力约3.77U/mg;4采用响应面分析法（RSM）,以人PGK为降糖活性因子作用靶点,GKARO-28-1675对PGK的激活率为响应值,对筛选体系和反应条件进行优化,得到该筛选平台的最优条件如下:4.1反应体系:总体积为150μL,含终浓度分别为60 mM Tris,2.11 mMMgCl2,4.0 mM ATP,6.0 mMβ-D（+）Glucose,1.0 mMβ-NADP,20 U/L G-6-PDH和20 U/LPGK;4.2反应条件:温度37℃,pH 7.0,反应时间13.7 min在340 nm处测定产物β-NADPH的光密度值（OD）。