腐食酪螨变应原Tyr p 28克隆、表达、纯化及免疫学特性鉴定

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目的:获得腐食酪螨变应原第28组分Tyr p28原核表达产物并鉴定其免疫活性。  方法:于腐食酪螨繁殖高峰季节(6-9月份)采集学生宿舍、宾馆床垫下及面粉厂尘样。在体式显微镜下,挑取单只孕螨放在含有混合培养基的小瓶内,置人工气候箱内(温度25±1℃,湿度85±5%,无光照)培养60天,倒置显微镜鉴定后扩增培养。提取纯培养腐食酪螨总 RNA,根据国际基因库(GenBank Accession Number KX060611)提供的Tyr p28编码区(CDS)序列设计特异性引物,反转录获得cDNA,然后扩增Tyr p28编码基因,并克隆至原核表达载体pET28a(+)中。测序验证后将质粒pET28a(+)-Tyr p28转化E.coli BL21(DE3)T1R,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达,将诱导表达产物用 SDS-PAGE和Western blot的方法进行鉴定。用固定化金属螯合亲和层析纯化重组表达的Tyr p28蛋白。微量紫外可见分光光度计对纯化蛋白进行定量分析。以腐食酪螨过敏性皮炎患者血清作为一抗,用Western blot方法分析Tyr p28的免疫学特性。  结果:成功实现腐食酪螨人工培养;构建了原核表达质粒pET28a(+)-Tyr p28,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)T1R诱导表达,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与患者血清IgE结合。重组蛋白的纯度为99%。重组过敏原 Tyr p28检测21份腐食酪螨过敏性皮炎患者血清中特异性IgE,阳性率为38.1%(8/21)。  结论:获得了腐食酪螨Tyr p28重组蛋白,其具有良好的免疫反应性。重组蛋白的获得为下一步标准化抗原临床特异性诊断和治疗研究奠定了基础。
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