弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,可引起人畜共患弓形虫病,感染率高、危害严重。棒状体蛋白16(ROP16)是弓形虫棒状体分泌的ROP2家族的蛋白,在虫体入侵时先进入宿主细胞的细胞质,然后到达细胞核,最终影响不同的信号通路,如影响免疫反应过程中的关键信号通路STAT3/6。本实验室前期试验证实,磺胺氯吡嗪钠(SPZ)具有最佳的抗弓形虫效果,对感染小鼠的保护率最高可达60%。为探究SPZ除了磺胺类药物均具有的抑制二氢叶酸还原酶之外的独特作用机制,我们进一步探究了SPZ复方药的抗虫效果,并构建ROP16缺失株及互补株,研究ROP16的生物学功能,探索SPZ抗虫作用与ROP16下调宿主天然免疫功能的相关性。首先,进行了SPZ复方对小鼠体内抗弓形虫疗效的观察,以挖掘SPZ的抗虫疗效,发现SPZ、磺胺嘧啶、黄芩苷、乳酸TMP、乙胺嘧啶和甘草在体外均可较好地抑制弓形虫增殖;单独使用SPZ(250mg/Kg、200mg/Kg)可保护部分小鼠存活(存活率分别为50%和25%),而单独使用其它参试药未能保护小鼠存活。当SPZ浓度为200mg/Kg时,基于叶酸代谢双重阻断原理而进行的SPZ与40-100 mg/Kg乳酸TMP/15-30 mg/Kg乙胺嘧啶联合用药无明显的协同作用,与单独给予200mg/Kg的SPZ试验组的小鼠存活率相同或略低,SPZ-黄芩-甘草使被感染小鼠存活率达到40%。提示我们在磺胺类药物均具有的干扰虫体的叶酸代谢而抑制虫体繁殖的作用机制外,需探索SPZ其它抗虫机制。然后,进行了弓形虫ROP16表达、ROP16缺失株的构建及其生物学功能研究。以pGEX-6P-1-ROP16和pCOLD1-ROP16重组质粒表达的ROP16全长和前半段均以包涵体形式表达;该蛋白可被犬弓形虫阳性血清识别,具有较好的免疫反应原性;获得的ROP16鼠多抗效价达到64000以上,可用于后续试验。运用CRISPR/CAS9系统成功获得ROP16缺失株和互补株。与RH株相比,ROP16敲除株的体外入侵率降低,刺激宿主产生的IL-12水平明显升高,对IL-5和IFN-γ无影响,对感染小鼠的致死性无明显的影响,说明ROP16是影响弓形虫入侵的关键因子,可以下调宿主IL-12的表达,猜测ROP16也在降低炎症反应和其它感染机制中发挥重要作用。最后,为探索SPZ新的抗虫机制,进行了SPZ作用的弓形虫透射电镜观察,发现弓形虫顶端复合体发生病变,棒状体顶端发生损伤。研究了SPZ治疗弓形虫感染鼠血清的IL-12表达水平,发现小鼠感染4h后用SPZ治疗,给药2h后小鼠产生的IL-12显著高于感染对照组,表明SPZ可致弓形虫感染小鼠产生高水平的促炎症反应因子IL-12,协助抗弓形虫。进行了SPZ对ROP16敲除前后的弓形虫的作用观察,发现低剂量(150mg/Kg)SPZ对RH株感染小鼠没有保护效果,而对ROP16缺失株感染鼠的保护率达到20%,表明ROP16的缺失解除了ROP16下调宿主天然免疫的功能,增加IL-12表达而提升SPZ抗虫作用。随着SPZ浓度增加,对RH株感染小鼠保护率逐渐升高,与ROP16缺失株感染鼠存活率呈现剪刀差,这一现象也表明SPZ可能影响ROP16下调节宿主天然免疫功能而起协助抗虫作用。综上所述,SPZ独特的抗弓形虫作用机制,除了通过干扰机体的叶酸代谢进而阻断虫体繁殖外,可能还影响了弓形虫ROP16下调宿主天然免疫的功能,使小鼠产生高水平的促炎症反应因子IL-12,进而提升了SPZ抗弓形虫作用。更详细的机制还需要进一步探究。