银杏内酯B诱导骨髓间充质干细胞分化的为神经样细胞及JAK/STAT3通路在细胞分化过程中作用的研究

来源 :徐州医学院 徐州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhuhao0000
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目的:研究银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对骨髓间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)分化为神经样细胞的诱导效应并探讨细胞分化与JAK/STAT3通路的关系。  方法:将四周龄SD大鼠(雌雄不限),颈椎脱臼处死,在无菌条件下,分离股骨和胫骨,冲洗骨髓腔制成单细胞悬液,利用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。调整细胞浓度接种入含胎牛血清培养基的培养瓶中,置于细胞培养箱内。按照贴壁培养法7-8天后传代,传至第3代后,应用流式细胞学技术对细胞进行鉴定。然后将纯化的BMSCs分为3组:1、银含内酯B(GB)组,使用银杏内酯B(40mg/L)处理。2、AG490组,加用JAK/STAT3通路抑制剂AG490(5μmol/L)处理。3、对照组,不做任何处理。培养7天后,于光镜下观察细胞形态:应用膜片钳技术,采用全细胞记录方式,对诱导前后的细胞进行电生理功能测定;采用免疫细胞化学染色方法分别检测巢蛋白(Nestin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)的情况,并计算阳性染色细胞的百分率;采用WesternBlot法对GB组和AG490组的STAT3及P-STAT3表达水平进行检测。最后采用SPSS16.0统计软件包进行资料分析。  结果:1.体外纯化培养BMSCs,在其传至3代后,细胞突起逐渐增多,细胞间可相互连接,并形成网状,细胞表现为辐射状、旋涡状排列。经流式细胞学鉴定,CD90,CD29,CD34,CD45表达分别为94.6%,87.6%,0.02%,3.71%。2.经银杏内酯B诱导7天后,细胞发生改变,可见细胞形态不规则,胞体收缩变圆,突起增多,折光性增强,继续诱导可见细胞间形成网络连接。3.在全细胞电压钳记录模式下,可记录到一系列内向电流,银杏内酯B组细胞较对照组细胞峰值电流增高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.各组细胞免疫荧光结果:银杏内酯B组及AG490组中GFAP,NSE,Nestin阳性细胞率较空白对照组均增多,差异有统计学意义(P<0.05);AG490组GFAP阳性细胞率较银杏内酯B组下降,差异有统计学意义(P<0.05);AG490组中NSE、Nestin阳性细胞数分别较银杏内酯B组增多,差异有统计学意义(P<0.05)。5.Western blot检测发现AG490组的P-STAT3的表达较银杏内酯B组减少,差异有统计学意义(P<0.05)。  结论:1.在体外培养中,银杏内酯B可以促进骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。  2.JAK/STAT3通路参与了骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞过程的调节,抑制该通路可以减少骨髓间充质干细胞向星形胶质细胞的分化,并促进其向神经元细胞的分化。
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