第一部分Tbx18+细胞谱系示踪模型的遗传性状研究　　谱系示踪技术是利用遗传性标记物标记细胞;对其子代细胞的增殖、分化、迁移进行追踪观察。是目前研究祖细胞或者干细胞分化最常用、最可靠的技术之一。谱系示踪技术常用P1噬菌体的Cre-LoxP位点特异性重组系统对特定细胞分化命运进行示踪。由于该修饰是通过Cre-LoxP系统介导的DNA重组;可遗传到子代细胞;因此可永久将某类细胞标记上报告基因从而研究其子代的分化命运。T-box转录因子18（Tbx18）是T-box家族的重要转录因子之一;近来研究发现Tbx18对一系列组织和器官的发育起重要的调节作用;特别是在保证泌尿系统的正常发育中扮演重要角色。Tbx18主要表达于细胞核;常规标记示踪方法无法永久、可靠地示踪其分化、迁移活动。因此;如何示踪肾脏组织分化发育过程中表达Tbx18的细胞及子代细胞的分化命运;存在一定技术难题。目前国际上较公认的方法是建立遗传谱系示踪模型;即Tbx18Cre 敲入小鼠和Cre报告小鼠（Rosa26LacZ 、Rosa26EYFP）交配建立Tbx18Cre/Rosa26EYFP或Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合遗传谱系示踪模型;从而解决了示踪Tbx18+肾间质祖细胞群分化命运的技术难题。遗传谱系示踪小鼠的遗传性状是否能稳定、可靠及真实反应Tbx18+细胞及子代细胞的分化命运;直接关系到实验的结果的真实性和准确性。因此;需对遗传谱系示踪小鼠遗传性状进行鉴定;判断该示踪技术应用于本研究的可靠性从而为后续研究奠定基础。　　目的： 鉴定Tbx18Cre/Rosa26EYFP或Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合遗传示踪模型遗传性状;建立一种能稳定、可靠示踪Tbx18+细胞分化命运的动物模型。　　方法：雌性Tbx18Cre小鼠与雄性报告小鼠（Rosa26LacZ、Rosa26EYFP）交配获取母系来源的Cre遗传示踪小鼠;即正交（positive mating;PM）示踪小鼠。雄性 Tbx18Cre 小鼠与雌性报告小鼠（ Rosa26LacZ 、Rosa26EYFP）交配获取父系来源的Cre遗传示踪小鼠;即反交（reverse mating;RM）示踪小鼠。通过Real time RT-PCR检测Tbx18的表达情况。一管酒精基因组抽提法提取小鼠标本的DNA;PCR及凝胶电泳鉴定小鼠基因型。体式荧光显微镜观察整体胚胎YFP表达;免疫荧光染色检测组织切片的YFP及Tbx18表达。整体胚胎及组织切片的X-gal 染色检测报告蛋白LacZ表达。　　结果:（1）子代鼠基因型鉴定提示PM所得的双杂合子代鼠比例符合孟德尔遗传规律;RM所得的双杂合子代鼠比例不符合孟德尔遗传规律。（2）整体胚胎X-gal 染色揭示表达报告蛋白β-gal的PM子代鼠比例符合孟德尔遗传规律;表达报告蛋白β-gal的RM子代鼠比例不符合孟德尔遗传规律。（3）整体胚胎X-gal 染色揭示PM所得双杂合子代鼠的报告基因LacZ能特异表达于胚胎;与整胚的免疫荧光染色结果一致。RM所得的双杂合子代鼠整胚X-gal 染色发现报告基因非特异性地表达于整个胚胎组织;与整胚免疫荧光染色结果一致。（4）整胚X-gal染色揭示PM示踪小鼠报告基因LacZ特异地表达于肾脏组织。（5）Real time RT-PCR提示Tbx18 mRNA表达于小鼠睾丸组织;而小鼠卵巢组织未见Tbx18 mRNA表达。（6）免疫荧光提示Tbx18蛋白特异性表达于小鼠睾丸组织;而小鼠卵巢组织未见Tbx18蛋白。（7）免疫荧光提示报告蛋白EYFP特异地表达于双杂合示踪小鼠的睾丸组织;且能在该部位与Tbx18共表达。双杂合示踪小鼠的X-gal染色提示报告蛋白LacZ能特异地表达于睾丸组织;与上述结果一致。　　结论：PM示踪小鼠能可靠示踪Tbx18+细胞的分化;而RM示踪小鼠不能特异地示踪Tbx18+细胞的分化。PM与RM所得子代鼠遗传性状存在差异的主要机制是雄性Cre小鼠的精子表达Tbx18;若将其作为交配小鼠能导致受精卵中Cre-loxp系统提前重组从而出现报告基因非特异性表达的假阳性结果。避免使用RM示踪小鼠可以防止假阳性结果的产生。　　第二部分：Cre-loxp重组系统介导的泌尿系遗传谱系示踪模型的建立　　如何在泌尿系统中通过Cre-loxp重组系统建立遗传谱系示踪模型从而在体内、体外示踪Tbx18+肾脏祖细胞的分化及其在肾脏发育和病理损伤中的作用是本课题需解决的关键技术问题。既往研究认为利用遗传谱系示踪技术建立Tbx18Cre/Rosa26EYFP/LacZ双杂合示踪小鼠模型;为追踪胚胎、新生及成年阶段肾脏组织Tbx18+细胞分化命运的可行方案之一。　　目的：探究Tbx18Cre/Rosa26EYFP及Tbx18Cre/Rosa26Lacz双杂合命运示踪小鼠模型是否是通过Cre-loxp重组系统建立的一种可靠、特异的泌尿系示踪模型。　　方法：雌性Tbx18Cre小鼠和雄性Rosa26LacZ交配;在其子代小鼠中用PCR及凝胶电泳鉴定出双杂合Tbx18Cre/Rosa26LacZ小鼠。采用整体器官X-gal染色检测报告基因LacZ的表达。雌性Tbx18Cre小鼠和雄性 Rosa26EYFP交配;在其子代小鼠中用 PCR 法鉴定出双杂合Tbx18Cre/Rosa26EYFP小鼠;整体器官免疫荧光染色检测报告基因EYFP的表达。　　结果：Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合小鼠泌尿系统整体及组织切片的X-gal染色发现肾、输尿管、膀胱组织特异性表达报告基因LacZ。体视荧光显微镜观察Tbx18Cre/Rosa26EYFP双杂合小鼠发现其泌尿系统能特异性表达报告基因EYFP。　　结论：Tbx18Cre/Rosa26EYFP及Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合命运示踪小鼠模型是一种通过Cre-loxp重组系统建立的泌尿系特异性示踪模型;能可靠地应用于泌尿系统的后续研究。　　第三部分 Tbx18+肾脏祖细胞向肾系细胞分化的多潜能性研究　　肾脏组织是一个由多种类型细胞构成的复杂器官。这些不同类型的细胞都对维持肾脏组织结构和功能具有重要意义。既往研究揭示Tbx18在肾脏发育中扮演重要作用。但是;Tbx18+肾脏祖细胞向肾系细胞分化的多潜能性需要进一步研究来验证。本部分研究应用Tbx18Cre/Rosa26EYFP及Tbx18Cre/Rosa26LacZ两种双杂合谱系示踪小鼠模型示踪观察Tbx18+肾脏祖细胞向肾系细胞分化;拟在生理条件下鉴定Tbx18+肾祖细胞向肾系细胞分化的多潜能性。　　目的：应用Tbx18Cre/Rosa26EYFP及Tbx18Cre/Rosa26LacZ两种双杂合谱系示踪小鼠模型追踪观察Tbx18+肾脏祖细胞向肾系细胞分化的命运。　　方法：Tbx18Cre/Rosa26EYFP双杂合成年小鼠肾脏组织行免疫荧光染色。体外原代培养新生小鼠肾脏细胞及免疫荧光染色。Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合成年小鼠肾脏组织切片X-gal染色。　　结果:（1）免疫荧光检测发现新生Tbx18Cre/Rosa26EYFP小鼠肾脏组织能出现报告蛋白EYFP与PDGFRβ、α-SMA、Perilipin、AQP1共表达;（2）Tbx18Cre/Rosa26EYFP成年示踪小鼠肾脏皮质和外髓中有一定量的EYFP阳性细胞表达;Tbx18Cre/Rosa26LacZ双杂合小鼠肾脏组织X-gal染色示肾小管及间质有β-gal的表达;（3）Tbx18Cre/Rosa26EYFP成年示踪小鼠EYFP+细胞同时表达近曲小管和髓袢降支细段的标记物AQP1;但未观察到肾脏组织EYFP和远端小管标记物calbindin共表达。此外;肾脏组织中少量EYFP+细胞还能表达集合管细胞的标记物AQP2;（4）新生小鼠肾脏中Tbx18+祖细胞来源的肾小管上皮细胞所占比例明显多于成年肾脏。　　结论：Tbx18+肾脏细胞在生理条件下能分化为肾脏成纤维细胞;血管平滑肌细胞;肾周脂肪细胞以及肾小管上皮细胞;说明其具有多分化潜能的祖细胞特性;在肾脏发育中能向多种肾系细胞分化。其中Tbx18+肾脏祖细胞参与新生小鼠肾小管分化的作用可能大于其参与成年肾脏组织分化的作用。　　第四部分 Tbx18+肾脏祖细胞在肾脏病理改变中的作用　　急性肾损伤(acute kidney injury;AKI)是缺血缺氧、药物、毒物或者炎症等因素所导致的急性肾小管坏死;是急性肾衰竭的常见类型之一。人类肾衰竭的治疗未取得实质性地进展;终末期肾病的治疗仍以透析或者器官移植等替代疗法为主。既往研究发现AKI受损的肾小管可以再生修复;但参与修复的细胞来源还存在一定的争议。在肾损伤因素的持续作用下;慢性肾损伤能出现肾小管间质纤维化等病理改变。肾纤维化是各类慢性肾脏病进展为终末期肾病的共同途径。肌成纤维细胞是肾纤维化的主要效应细胞。探究肾肌成纤维细胞的来源对于揭示肾纤维化的形成机制有一定的研究价值;从而为肾纤维化治疗提供一定的思路。　　目的：探究病理条件下Tbx18+肾脏祖细胞对于肌成纤维细胞和肾小管上皮细胞的分化作用。　　方法：建立Tbx18Cre/Rosa26EYFP/LacZ等双杂合小鼠的单侧输尿管梗阻（UUO）及叶酸肾病(FAN)模型。Tbx18Cre/Rosa26YFP/LacZ肾脏组织冰冻切片HE染色、免疫荧光染色及X-gal染色。　　结果：（1）FAN肾脏组织HE染色发现部分肾小管管腔堵塞;小管上皮坏死;间质可见炎性细胞浸润;（2）急性肾损伤后表达Tbx18的细胞增多;且同时表达EYFP和近曲小管和髓袢降支细段的标记物AQP1的细胞增多;（3）UUO手术侧肾脏出现积水;肾盂扩大;肾实质受压变薄;HE染色显示肾小管扩张或者萎缩;肾间质区域增宽;炎症细胞浸润明显;（4）UUO手术侧肾脏组织免疫荧光染色发现肾脏间质YFP+细胞表达PDGFR-β增加且EYFP+细胞大量表达肌成纤维细胞的标记物α-SMA。　　结论：急性肾损伤模型中;Tbx18+肾间质祖细胞分化为肾近曲小管和髓袢降支细段上皮细胞增多;但仍不能分化为肾远端小管。在UUO模型中;Tbx18+肾脏祖细胞不仅分化为肾成纤维细胞增加;而且能分化为纤维化的关键效应细胞—肌成纤维细胞从而导致肾纤维化的发生。