现如今,猪卵母细胞激活方法和相关激活参数的研究己经比较成熟,但激活的效率仍然很低。此外,由于卵母细胞激活是细胞核移植等生物技术的关键环节,提高孤雌激活效率也可以促进细胞核移植技术的提高。AZD5438是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制剂,在体外试验中,AZD5438可通过抑制CDK底物的磷酸化,从而阻断细胞周期。本试验目的是探索AZD5438对猪孤雌激活与体细胞核移植胚胎体外发育的影响,为研究新型的MPF抑制剂,优化猪卵母细胞体外激活程序奠定基础。本研究主要内容及结果如下:1.试验探索了 AZD5438的最佳处理条件。采用不同处理浓度(10μM,20μM和50μM)的AZD5438分别处理电激活后的猪卵母细胞孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)胚胎,通过比较体外猪PA囊胚率得出,添加10μM AZD5438的试验组囊胚率最高,并且显著高于5 μg/ml细胞松弛素 B(cytochalasin B,CB)组(46.4%vs.34.5%,P<0.05)。随后,采用10μM AZD5438分别处理电激活后的猪PA胚胎不同时间(2h,4h和6h)。结果表明,在10μMAZD5438处理4 h的条件下,猪PA囊胚发育率高于其他时间组(42.8%vs.38.6%,37.2%),但并无显著差异性。2.试验将 AZD5438 和 6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine,6-DMAP)对猪 PA 胚胎与体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)胚胎早期发育的影响进行比较。采用10μMAZD5438和2mM6-DMAP分别处理电激活后的猪PA胚胎和猪SCNT胚胎4h,比较PA囊胚率和猪SCNT囊胚率。结果表明,10μM AZD5438处理4 h的条件下得到了与6-DMAP处理组相似的猪PA囊胚率(42.4%vs.34.3%)和SCNT囊胚率(13.40%vs.11.11%)。3.试验对经10μMAZD5438处理4h后得到的猪PA囊胚进行核型分析。结果表明,10μM AZD5438组猪囊胚中60%为二倍体,10%猪PA囊胚的为单倍体,10%猪PA囊胚的为四倍体,20%猪PA囊胚的为杂合体。4.试验将使用10μM AZD5438和5 μg/ml CB处理4h得到的猪PA胚胎内成熟促进因子(MPF)活性水平进行测定。结果表明,10μMAZD5438处理显著降低猪PA胚胎中MPF活性水平(125.8 vs.288.7,P<0.05)。5.试验采用Real-time PCR方法检测多能相关基因(Sox2、0ct4和Nanog)和凋亡相关基因(Bcl-2和Bax)的相对表达量,研究11μ AZD5438处理猪孤雌激活胚胎4 h后,对基因表达、胚胎发育能力的影响。结果表明,10 μM AZD5438处理猪PA胚胎4h,对多能相关基因(Sox2、0ct4和Nanog)和凋亡相关基因(Bcl-2和Bax)的相对表达水平与CB对照组(5μg/mml)无显著差异。上述研究结果表明,AZD5438通过降低猪PA胚胎内MPF活性水平来提高猪PA胚胎体外发育能力,并在10μM AZD5438处理4h的条件下,能够提高猪孤雌激活胚胎与体细胞核移植胚胎体外发育水平。除此之外,孤雌囊胚中多能性相关基因(Sox2、Oct4和Nanog)和凋亡相关基因(Bax和Bcl-2)的相对mRNA表达水平没有差异。证明AZD5438处理能够提高孤雌胚的体外发育水平,可作为一种新型MPF抑制剂应用于卵母细胞激活体系之中。