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目的运用现代药理学方法,研究桑黄菌丝体多糖对肝癌H22荷瘤小鼠和胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用,并探讨其作用机制。运用分离纯化方法对桑黄菌丝体多糖进行分离纯化,并采用现代分析方法对均一组分进行结构鉴定,以期了解桑黄菌丝体多糖的组成,为桑黄多糖的药理研究以及结构分析提供实验和理论依据。方法(1)将发酵培养的桑黄菌丝体采用水提醇沉法提取多糖。将60只昆明种小鼠随机分成空白组、模型组、阳性对照组(环磷酰胺)、桑黄菌丝体多糖低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组,每组10只。除空白组外,其余各组均在小鼠左前肢皮下注射0.2 mL H22肝癌细胞,建立肝癌H22荷瘤小鼠模型。连续给药15 d后,眼球取血处死小鼠,剥取瘤块,称重并计算抑瘤率。摘取脾脏和胸腺,称重并计算脾指数和胸腺指数。ELISA法测定血清中IL-2,IL-6,TNF-α的含量。MTT法测定脾细胞中T、B细胞的增殖能力。做瘤块的组织病理切片,显微镜下观察。免疫组化法检测肿瘤组织中Bax和Bcl-2蛋白的表达。(2)将60只Wistar雄性大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组(塞来昔布)、桑黄菌丝体多糖低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组,每组10只。除空白组外,其余各组均在右后足致炎,建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型。给药期间采用足趾肿胀容积法测定大鼠非致炎足关节肿胀程度。30d后麻醉大鼠,截取非致炎足做关节组织病理切片,显微镜下观察。ELISA法检测血清中白介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)的表达水平。(3)桑黄菌丝体多糖经DEAE Sepharose FastFlow阴离子交换树脂分离、Sephacryl S-300 High Resolution凝胶树脂纯化后,得到均一组分。将多糖组分做紫外全扫描鉴定其纯度;高效液相联合示差折光检测器测定其分子量;三氟乙酸(TFA)水解、硼氢化钠(NaBH4)还原、乙酸酐乙酰化后上气相-质谱(GC-MS)分析其单糖组成成分;红外光谱分析其光能团;甲基化反应后,经三氟乙酸(TFA)水解、硼氢化钠(NaBH4)还原、乙酸酐乙酰化后上气相-质谱(GC-MS)分析其连接方式。结果(1)各给药组的抑瘤率分别为:阳性对照组,79.36%;桑黄菌丝体多糖低剂量组,26.71%;桑黄菌丝体多糖中剂量组,34.48%;桑黄菌丝体多糖高剂量组,56.65%。与模型组相比,桑黄菌丝体多糖高、中剂量组和阳性对照组的瘤重均明显减轻(P<0.05),胸腺指数和脾指数没有显著性差异(P>0.05),除桑黄菌丝体多糖低剂量组中的TNF-α没有显著差异外,各给药组的血清细胞因子IL-6、IL-2、TNF-α均明显升高(P<0.05)。在T淋巴细胞增殖实验中,与模型组相比,桑黄菌丝体多糖高剂量组的吸光度(A)值明显升高(P<0.05)。在B淋巴细胞增殖实验中,桑黄菌丝体多糖各剂量组的A值均高于模型组,但只有高剂量组有显著性差异(P<0.05)。桑黄菌丝体多糖各剂量组中的H22肿瘤细胞则排列疏松,多有肿胀和变性,坏死细胞明显增多。H22肿瘤细胞中Bax和Bcl-2的阳性细胞均呈弥漫性分布,结合IPP软件计算的平均光密度(OD)值可知,模型组中的Bax蛋白表达呈弱阳性,Bcl-2呈强阳性,而阳性对照组和桑黄菌丝体多糖各剂量组中的Bax蛋白表达呈强阳性,Bcl-2呈弱阳性,并且均与模型组有显著性差异(P<0.05)。(2)与模型组比较,阳性对照组和桑黄菌丝体多糖各剂量组均能显著抑制非致炎足足趾肿胀(P<0.05),改善关节组织病理情况,降低IL-17、TNF-α、IL-1β的表达(P<0.05),升高 IL-10 的含量(P<0.05)。(3)桑黄菌丝体多糖经过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂分离和Sephacryl S-300 High Resolution凝胶树脂纯化后,得到P1A1和P1B两种组分。紫外全扫描表明两个组分均为单一组分。经高效液相联合示差折光检测器检测,计算出P1A1的分子量Mw为58313,P1B的分子量Mw为27365。GC-MS分析单糖组成,可知P1A1是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五种已知单糖和甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷三个推测得到的成分组成;P1B是由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖三种已知单糖和甲基-α-D-吡喃甘露糖苷组成。红外光谱扫描结果表明:P1A1属于吡喃糖苷,含有α-糖苷键和β-糖苷键,是由含有酸性残基的单糖组成的聚合糖;P1B属于吡喃糖苷,有α-糖苷键的存在,是由不含有酸性残基的单糖组成的聚合糖。GC-MS分析P1A1和P1B甲基化衍生物对应的连接方式,P1A1有四种连接方式,分别为:2,3,4,6-Me4-Glc 为 Glcp(1→连接,2,3,6-Me3-Glc为→4)Glcp(1→连接,2,3,4-Me3-Gal 为→6)Glap(1→连接,2,4-Me2-Man 为→3,6)Manp(1→连接;P1B有四种连接方式,分别为 2,3,4,6-Me4-Glc 为 Glcp(1→连接,2,3,6-Me3-Glc 为→4)Glcp(1→连接,2,3,4-Me3-Gal 为→6)Glap(1→连接,2,4,6-Me3-Man 为→3)Manp(1→连接。结论(1)桑黄菌丝体多糖可以通过调节机体免疫器官,促进细胞因子IL-6、IL-2、TNF-α的表达,增加T、B淋巴细胞的增殖,增加Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,使凋亡的肿瘤细胞增多,达到抑制肿瘤的效果。(2)桑黄菌丝体多糖通过抑制炎症细胞因子IL-17、TNF-α、IL-1β的表达,促进抑炎因子IL-10的表达对CIA大鼠起到治疗作用。(3)运用分离纯化方法对桑黄菌丝体多糖进行分离纯化,并采用现代分析方法对其均一组分P1A1和P1B进行结构鉴定,为桑黄菌丝体多糖结构的进一步研究提供了一定的实验基础。