背景和目的牙髓病、根尖周病会伴随着牙髓的感染或坏死。作为临床髓病治疗的首选方法,根管治疗可以通过有效的控制炎症从而缓解病人的痛苦。但是其缺点在于经过根管治疗的牙齿就会彻底失去牙髓,失去神经血管的营养作用,随着时间的推移会变色,变脆,易折,抗力强度明显降低。因此如何让牙髓再生成为髓病研究的重中之重。在牙髓再生的众多研究方法中,外源性干细胞移植获取牙髓再生是其中一个重要的研究方向。目前,已有若干的实验研究证实,通过移植外源性干细胞可以获取类牙髓样组织的再生。虽然干细胞移植所取得的研究结果让人振奋,但是其往临床应用的转化却面临着巨大的困难及挑战。一方面,干细胞的提取与培养,干细胞的体外扩增及储存等程序相当复杂,另一方面,干细胞的植入方式、手段和剂量标准、免疫反应以及干细胞移植所引起的伦理等一系列的问题都是不可避免的,最后,还有一个不可忽视的问题便是干细胞移植所产生的高额费用。从口腔医师的视角分析,在牙髓病的治疗策略上,寻找较为实用和经济的方法应该是我们未来研究的方向。在总结国内外最新研究成果的基础上,通过让内源性细胞归巢来替代外源性细胞移植,从而避免体外细胞培养和体内细胞移植等复杂的程序而获取牙髓再生成为新的研究焦点。骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)作为一种可以向多种组织细胞分化的多能的干细胞,已被证实可以感受外界信号刺激,趋化至机体的受损部位,同时进一步发生细胞分化而发挥其治疗作用。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是一类对干细胞尤其是骨髓基质干细胞的迁移有明显的趋化作用的趋化蛋白,可以与干细胞表面的特异性受体结合形成偶连分子对,通过偶连分子对调控细胞的粘附、运动、分泌、增殖等生物学行为。众多实验证实在心肌梗死、脑损伤、骨折及肺损伤等情况下,损伤区域的SDF-1表达会上调,而表达上调的SDF-1则可以募集MSCs迁移至损伤区域并修复损伤。我们设想机体内系统性来源的骨髓基质干细胞能否感受到信号刺激,迁移并归巢到根管内,进一步进行细胞分化从而参与牙髓的再生。为了对我们的设想进行验证,我们首先通过绿色荧光蛋白标记技术(GFP)对获取的状态良好的骨髓基质干细胞进行标记。GFP无需反应底物便能产生荧光,优点是性质稳定、敏感度高、无毒性副作用。我们通过小鼠的鼠尾静脉将GFP+骨髓基质干细胞移植到小鼠体内,将含有SDF-1的胶原人牙根置于小鼠的皮下袋内,通过组织学观察是否会有类牙髓样的新生组织在根管内出现;利用GFP的示踪功能首次探讨系统性的骨髓基质干细胞是否可以归巢至根管内并参与牙髓样组织的再生过程;利用免疫突光显微镜、免疫组化染色等方法观测GFP+骨髓基质干细胞在新生的类牙髓样组织中的分布及其可能出现的分化,评估外源性SDF-1促进骨髓基质干细胞向根管的归巢并促进牙髓再生的能力。材料与方法1.骨髓基质干细胞的培养和转染我们使用的是ST2小鼠骨髓基质细胞。首先对细胞进行复苏,并稳定传代。传代后首先对最适感染复数进行确定。当感染复数(Multiplicity of infection MOI)大于等于60时转染细胞的绿色荧光表达率可明显达到最高,故将60确定为最适感染复数。然后确定G418的最适筛选浓度。将细胞培养在含不同浓度的G418的培养基中10-14天,当G418浓度大于200μg/mL后细胞全部死亡,故确定G418的最适筛选浓度和维持浓度分别为200μg/mL和100μg/mL。慢病毒感染BMSCs,经G418筛选后,可获取GFP稳定表达的阳性BMSCs细胞,而后体外大量扩增备用。2.小鼠骨髓基质干细胞的尾静脉移植及动物模型的建立收集离体正畸拔除的单根管第一前磨牙,于冠根联合处沿近远中向截断牙根,行根管预备,根尖孔扩大至直径0.5毫米。将牙根用次氯酸钠、EDTA、无菌PBS进行系列预处理后,置于含有双抗的PBS中备用。收集体外扩增的GFP+骨髓基质干细胞,移植组每只小鼠将100μL细胞悬液(1×106细胞)经尾静脉注射移植入小鼠体内,对照组注射100 μ L不含血清的α-MEM培养液。在背部皮肤作一个长约1cm纵向切口,然后用止血钳钝性分离,暴露皮下组织,形成皮下袋,54只雄性5-7周龄小鼠,随机分为三组:SDF-1组(置入皮下袋的牙根根管内含有融入100ng/mL的SDF-1的中性三维胶原+尾静脉移植GFP+骨髓基质干细胞),SDF-1空白组(置入皮下袋的牙根根管内仅含有中性三维胶原+尾静脉移植GFP+骨髓基质干细胞),对照组(置入皮下袋的牙根根管内仅含有中性三维胶原+尾静脉注射α-MEM培养液)。牙根置入小鼠皮下袋内并严密缝合,三周后处死小鼠获取牙根标本。进行苏木精和伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察根管内类牙髓样的新生组织,同时对新生组织内新生血管的面积进行测量并比较,以评价SDF-1对血管再生的作用。切片脱蜡水化后,用DAPI染色细胞核并通过荧光显微镜直接观测GFP+细胞在根管内新生类牙髓样组织中的分布情况,利用图像处理软件检测移植GFP+细胞的归巢率,评价SDF-1对移植细胞归巢的作用;用免疫组化染色的方法检测GFP+细胞在类牙髓样新生组织中的分布及可能的分化,并检测类牙髓样的新生组织中碱性磷酸酶(硬组织矿化指标)的表达。结果1.骨髓基质干细胞的培养及转染ST2细胞经过复苏并稳定传代后,选取状态良好的BMSCs细胞,利用携带GFP基因的慢病毒感染细胞,可通过荧光显微镜直接观察转染效果。48小时左右即可观察到绿色荧光的出现,72-96小时绿色荧光达到最强,大部分细胞呈现明亮的绿色荧光。转染后的BMSCs细胞生长状态依然良好,形态并未发生明显改变;经过G418筛选后,BMSCs细胞生长状态未受影响。筛选后将获得的GFP+骨髓基质干细胞进行大量扩增,随着细胞传代,GFP+细胞生长状态良好,GFP表达稳定。2.动物模型中GFP+骨髓基质干细胞的归巢及根管内类牙髓样新生组织的形成对照组中仅存有胶原组织,未观测到成形细胞和血管的存在。在SDF-1组及SDF-1空白组中,均出现了类牙髓样组织的再生、新生血管的形成、绿色荧光蛋白及碱性磷酸酶的阳性表达。SDF-1空白组中,光学显微镜下我们可以看到残余的胶原纤维成网格状排列,网格中有少量细胞存在,同时视野中有少量的新生血管。倒置荧光显微镜下可观测到少量的GFP+细胞(绿浆蓝核),免疫组化染色显示绿色荧光蛋白和碱性磷酸酶的表达比较微弱。在SDF-1组中,网格状的胶原支架基本消失,代替它的是大量的细胞和新生血管,归巢的GFP+细胞数总量、新生血管的面积明显大于SDF-1空白组,绿色荧光蛋白及碱性磷酸酶的表达明显强于SDF-1空白组,SDF-1组与SDF-1空白组之间的GFP(IOD)及ALP(IOD)差异具有统计学意义。结论1.携带GFP的慢病毒能够高效转染骨髓基质干细胞,且转染后的骨髓基质干细胞可以稳定而持久表达GFP,能于体外大量扩增。2.可通过内源性细胞归巢的方式获取类牙髓样组织的再生。3.机体内系统性来源的骨髓基质干细胞可以归巢到根管内并参与类牙髓样组织再生及分化。4.SDF-1的局部应用可以提升骨髓基质干细胞的归巢效率并增强新生组织的血管化。