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研究背景:术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老年患者在接受麻醉和手术后出现的一种中枢神经系统(central nervous system,CNS)并发症,主要表现为精神错乱、焦虑、人格的改变、智力降低以及记忆受损,常持续数周或数月,对患者术后的康复产生严重的影响。POCD的病理机制至今尚未阐明,有学者认为手术引起的中枢炎症是引起POCD的主要机制。手术创伤可以活化机体固有免疫系统引起外周免疫细胞激活和相应细胞因子的释放,相关免疫信息传入大脑,导致中枢免疫相关细胞活化,释放炎症介质,损伤海马神经元,引起认知功能的下降。中枢炎症的发生发展是一个非常复杂的过程,有多种因素的参与。近些年来,脑内肥大细胞在中枢炎症中的作用越来越受到研究者的关注。脑内肥大细胞(mast cells,MCs)多位于丘脑、下丘脑、海马、脉络丛软脑膜、硬脑膜等血脑屏障周围脑实质侧,通过预储存以及重新合成的炎症介质,如组胺,类胰蛋白酶,5羟色胺,肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF),白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等,作用于星形胶质细胞,小胶质细胞和血管内皮细胞等,在中枢炎症的发生发展中发挥着重要的作用。我们前期研究发现,SD大鼠胫骨骨折术后脑内肥大细胞数量显著增多,肥大细胞稳定剂色甘酸钠能抑制外周手术引起的中枢炎症,血脑屏障破坏,认知功能减退。这提示了肥大细胞在手术引起的中枢炎症中发挥了重要的作用。外周手术如何引起脑内肥大细胞激活尚未清楚。手术引起大量炎症因子释放入血液循环,其中,高迁移率族蛋白-1(high mobility group box-1,HMGB-1)是一种强效的促炎因子。HMGB-1参与了多种神经退行性病变的发生发展,在中枢炎症和认知功能减退的发生中发挥了重要的作用。HMGB-1是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白,由坏死或感染的细胞被动分泌和特定的细胞(如巨噬细胞)主动分泌,以损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)发挥促炎作用。HMGB-1具有细胞因子样作用,通过与细胞表面表达的天然受体相互作用激活免疫细胞而引起炎症反应,如晚期糖基化终产物受体(the Receptor of Advanced Glycation Endproducts,RAGE)。RAGE是一种膜结合受体,可被大量配体激活,如晚期糖基化终产物(AGEs),HMGB-1,β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)和S100B/S100A12等。这些配体与RAGE结合后,它们都能够激活NF-κB信号通路。NF-κB信号通路被认为在许多中枢神经系统(CNS)病理过程中起重要作用,如神经炎症,神经变性和记忆障碍。尽管在所有CNS细胞中已经证实了NF-κB的活性,但目前的研究集中在RAGE/NF-κB信号传导途径及其配体在神经元和神经胶质细胞中的功能。那么,在外周手术致中枢炎症的过程中,HMGB-1是否通过RAGE/NF-κB信号通路激活脑内肥大细胞而引起中枢炎症的发生这一问题仍然不清楚。研究目的:探讨HMGB-1是否是通过激活脑内肥大细胞而引起中枢炎症?此作用是否与RAGE/NF-κB信号通路相关?研究方法:一、离体实验:使用P815 MCs株研究HMGB-1对MCs激活作用及其作用机制。1.分别使用10,50,100和200 ng/ml的rHMGB-1孵育P815 MCs 24小时或48小时后,使用WST-8法检测HMGB-1对肥大细胞存活率的影响。2.分别使用100ng/ml的HMGB-1,lμg/ml的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,MCs炎症因子释放刺激剂)和lμg/ml的C48/80(MCs脱颗粒刺激剂)刺激P815MCs后。将P815 MCs分为CONTROL组,LPS组,C48/80组。使用ELISA,免疫荧光,real-time PCR检测P815 MCs脱颗粒类胰蛋白酶的释放以及炎症介质TNF,IL-1β的合成与释放。3.使用100ng/ml的HMGB-1刺激P815 MCs后,Western-blot和免疫荧光检测肥大细胞表面受体TLR2(Toll-like receptor 2),TLR4(Toll-like receptor 4),RAGE的表达量的变化。4.使用RAGE-SiRNA沉默P815 MCs表面RAGE的表达,将P815 MCs分为四组:negtive control(NC)组、RAGE-siRNA组、HMGB-1组、HMGB-1+RAGE–siRNA,观察RAGE受体沉默后P815 MCs的激活是否被抑制。随后使用Western-blot检测NF-κB信号通路磷酸化水平。观察RAGE/NF-κB信号通路在HMGB-1激活P815 MCs中的作用。二、在体实验:在SD(Sprague-Dawley)大鼠侧脑室定位注射肥大细胞稳定剂色甘酸钠(cromoglycate,Cro)或无菌生理盐水后腹腔注射HMGB-1。将雄性(SD)大鼠分为4组:单纯侧脑室注射无菌生理盐水组(CONTROL组),单纯侧脑室注射色甘酸钠(CRO,MCs稳定剂)组(CRO组),侧脑室注射无菌生理盐水30min后腹腔注射HMGB-1组(HMGB-1组),侧脑室注射色甘酸钠30min后腹腔注射HMGB-1组(CRO+HMGB-1组)。药物处理24小时后甲苯胺蓝染色及类胰蛋白酶染色检测大鼠海马CA1区肥大细胞数量的变化,Elisa检测炎症因子的分泌(TNF和IL-1β),Western-blot检测血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)通透性变化有关蛋白(occludin,白蛋白)及与RAGE/NF-κB信号通路激活有关蛋白(p-P65,p-iκBα)。实验结果:一、细胞实验结果:(1)细胞毒性试验结果显示,不同浓度的HMGB-1在24或48小时后对P815 MCs的存活率无显着影响。。(2)与CONTROL组相比,C48/80(P<0.01)与HMGB-1(P<0.01)均能刺激P815 MCs脱颗粒释放预储存的类胰蛋白酶;与CONTROL组相比,HMGB-1刺激P815 MCs炎症因子TNF mRNA水平表达在6h达到峰值(P<0.01),炎症因子IL-1βmRNA水平表达在12h达到峰值(P<0.05);HMGB-1能显著增加P815 MCs的TNF(P<0.05)与IL-1β(P<0.01)蛋白水平表达。(3)与NC组相比,HMGB-1能诱导P815 MCs表面RAGE的上调(P<0.05),RAGE-siRNA能显著抑制P815 MCs表面RAGE的表达(P<0.01)。(4)与NC组相比,单独RAGE-siRNA组无显著差异,HMGB-1组类胰蛋白酶及TNF和IL-1β的表达量明显升高(P<0.05);与HMGB-1组相比较,RAGE-siRNA+HMGB-1组类胰蛋白酶及TNF和IL-1β的表达显著下降(P<0.05)。(5)与NC组相比,单独RAGE-siRNA组无显著差异,HMGB-1刺激能显著增加RAGE/NF-κB信号通路相关蛋白P65和ikBα的磷酸化(P<0.05);与HMGB-1组相比较,RAGE-siRNA+HMGB-1组P65和ikBα的磷酸化明显下降(P<0.05)。(6)在体实验中,与CONTROL组相比,单纯侧脑室注射色苷酸钠组无明显改变,HMGB-1组中大鼠海马CA1区肥大细胞数量明显增加(P<0.05),海马炎症因子TNF,IL-1β表达升高(P<0.01),紧密连接蛋白occludin水平下降(P<0.05),白蛋白水平升高(P<0.01),P-P65表达升高(P<0.05),P-ikBα表达升高(P<0.01)。预先给予侧脑室注射肥大细胞稳定剂色甘酸钠能抑制HMGB-1诱导的上述作用。结论:本研究结果表明,HMGB-1可以分别激活P815 MCs株脱颗粒释放炎性介质、激活脑内肥大细胞引起中枢炎症的发生。此作用与RAGE/NF-κB信号通路的激活相关。