随着科技的发展,各类电子产品、电力设备广泛使用,由此产生的各种不同频率的电磁场已经成为继空气、噪声和水源污染后的第四大污染,严重影响和威胁人类健康。极低频电磁场(ELF-EMF)和射频电磁场(RF-EMF)是我们日常生活中接触到的最普遍的两种电磁场。许多研究表明,ELF-EMF和RF-EMF暴露与人类健康损害和部分疾病的发生具有一定的相关性,包括儿童白血病、脑肿瘤、Lou Gehrig疾病以及老年痴呆症病等。由于雄性生殖器官对环境有害物质非常敏感,随着近年来精液质量下降和不育的人群越来越多,人们开始密切关注ELF-EMF和RF-EMF对雄性生殖健康的潜在危害。然而,目前关于ELF-EMF和RF-EMF是否具有明显的雄性生殖毒性的流行病学研究以及实验研究结果还很不一致,而且关于ELF-EMF和RF-EMF暴露对(男)雄性生殖毒性以及机制也均不清楚。因此系统的开展ELF-EMF和RF-EMF生殖毒性效应及其机制的研究,对于全面认识二者对人类健康的影响及防治具有重要的意义。DNA甲基化是表观遗传修饰的途径之一。它指的是在DNA甲基化转移酶的作用下将活性S-腺甲硫胺酸(S-aerosol-mentioning,SAM)转移至DNA分子胞嘧啶环5-C位点使其转变为5-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是一种广泛的表观遗传调控机制。一般而言,基因启动子区高甲基化会抑制其表达。因此DNA甲基化在基因表达调控中起重要作用,而且广泛参与了各种生命活动和疾病的发生。miRNA是表观遗传学调控的另一重要途径,作为一类内源性非编码小RNA(长度大约在19~25核苷酸),它几乎存在于所有的生物体中,包括动物、植物和病毒。miRNA主要的生物学功能是通过结合靶基因的3’非翻译区从而在转录后水平上调控基因的表达。miRNA通过与靶基因的结合能够抑制靶mRNA的翻译或提高mRNA的降解。miRNA介导的细胞调控是一种重要的表观遗传机制的调控途径,人类基因组中约60%的基因都受到miRNA的调控,miRNA介导的细胞调控几乎涉及参与全部的细胞进程,如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡以及细胞周期等,且miRNA与多种人类肿瘤和男性生殖障碍密切相关。越来越多的证据表明,DNA甲基化和miRNA对精子的生成和男性的生育能力至关重要。鉴于EMF暴露对雄性生殖健康的潜在危害值得关注,但现有研究未得出明确的结论。存在较大争议的原因一方面可能与无标准暴露装置,暴露频率、强度、时间不一,检测方法和细胞敏感性不同等有关;另一方面,不少研究发现ELF-EMF和RF-EMF没有明显的遗传毒性。因此,本研究拟从表观遗传学这一新的角度入手,系统的评价EMFs暴露是否对DNA甲基化以及miRNA等主要的表观遗传学调控产生影响;筛选关键性dna甲基化调控应答基因和mirna,并初步分析相关的dna甲基化调控基因和mirna在emfs暴露过程中的功能及其机制。为进一步全面认识电磁辐射的损伤效应与医学防护提供理论依据和研究材料。本论文主要研究内容和结果如下:(1)50hzelf-emf的表观遗传学研究(1)以不同电场强度(1mt,2mt和3mt),间歇式暴露模式(5min开10min关)建立50hzelf-emf暴露条件下小鼠gc-2细胞的表观遗传学细胞研究模型。暴露72h后采用cck-8和流式细胞术等分析方法发现,不同场强的50hzelf-emf暴露对gc-2细胞的形态、生长没有明显的影响,对gc-2细胞的细胞周期和凋亡也没有明显的影响(p>0.05)。表明50hzelf-emf短期暴露在体外没有明显的细胞功能改变。(2)全基因组dna甲基化水平定量分析发现:50hzelf-emf暴露后,1mt暴露组gc-2细胞dna的甲基化水平明显降低;2mt和3mt暴露后,gc-2细胞全基因组甲基化水平升高(p<0.05),表明50hzelf-emf暴露可以导致gc-2细胞dna异常甲基化。初步的机制研究表明,在50hzelf-emf暴露条件下,dnmt1、dnmt3b的mrna和蛋白的表达水平明显改变,表明相关的dna甲基化转移酶参与了50hzelf-emf致gc-2细胞全基因组甲基化水平的改变。(3)利用dna甲基化芯片初步筛选了50hzelf-emf暴露条件下主要的差异甲基化基因,建立了全基因组甲基化差异图谱。其中有400多个基因发生了明显的甲基化改变,表明50hzelf-emf暴露可能通过调控相关基因的甲基化产生生物学效应。通过对部分候选基因dna甲基化状态的进一步分析,结果发现nod1、lrrc9、tagln等基因启动子区明显甲基化,且负调控相关基因的表达,表明相关基因不仅可以作为50hzelf-emf暴露的候选标志物,而且可能在50hzelf-emf诱发的生物学效应中起重要作用。(4)利用表达谱芯片建立了50hzelf-emf暴露下差异基因表达谱。在1mt暴露条件下共有84个差异表达基因(其中包括44个基因上调,40个基因显著下调);在3mt暴露条件下,差异表达的基因共有324个,其中包括235上调的基因和89个下调的基因。进一步分析发现50hzelf-emf暴露下,maoa、bhmt、gng8、ugt2b34、dgat1和adh1等基因可能是1mt暴露条件下关键应答靶基因;而cyp3a11、ugt2b34、adcy5、ptgs1和cyp2b23等基因是3mt暴露条件下核心的靶基因。通过对相关基因表达验证结合生物信息学分析发现,这些关键性差异表达的基因主要涉及到免疫应激、组蛋白修饰、氧化应激等信号通路,提示50hzelf-emf可能影响相关的信号通路而产生生物学效应,为后续的深入研究提供了研究资料。(5)通过mirna表达谱芯片建立了50hzelf-emf暴露条件下差异mirna表达谱。结果表明:50hzelf-emf暴露可以明显诱导mirna差异表达。1mt暴露组共有19个mirna的表达发生改变,其中有7个mirna表达上调,12个mirna表达下调。在3mt暴露组,差异表达的mirna共有36个,其中有9个mirna表达上调,27个mirna表达下调。进一步分析发现,在1mt暴露组中,mir-211-3p、mir-494-3p、mir-669f-3p和mir-1907是关键性应答mirna。然而,在3mt暴露组,mir-30e-5p、mir-210-5p、mir-224-5p、mir-196b-5p、mir-504-3p、mir-669c-5p和mir-455-3p是关键性应答mirna。这些差异表达mirna可能与elf-emf的生物学效应密切相关。采用go和kegg对mirna靶基因所涉及的信号通路分析发现,相关的mirna靶基因主要参与mtor信号通路、昼夜节律信号通路、p53信号通路、长期抑郁和mapk信号通路等信号通路,提示50hzelf-emf可能通过mirna影响上述信号通路和相关的生物学功能。我们的研究也表明这些显著改变的mirna可作为候选的生物标志物。(6)我们首次发现不同场强的50hzelf-emf能够改变gc-2细胞中mir-26b-5p的表达水平。单独过表达或者沉默mir-26b-5p对gc-2细胞的生长、凋亡以及细胞周期没有明显影响。但是过表达mir-26b-5p再暴露于3mt50hzelf-emf会引起gc-2细胞由g0/g1期向s期转换,提示mir-26b-5p与50hzelf-emf存在着明显的交互作用。进一步的机制分析表明,ccnd2是mir-26b-5p的一个直接的靶基因,mir-26b-5p的表达与ccnd2的表达呈负相关。进一步的实验表明50hzelf-emf与mir-26b-5p表达都可以改变ccnd2mrna和蛋白的表达水平从而影响细胞周期。相关研究首次表明mir-26b-5p-ccnd2在gc-2细胞暴露于50hzelf-emf过程中对细胞周期的调控发挥重要作用。(2)1800mhzrf-emf的表观遗传学研究(1)以不同比吸收率(1w/kg、2w/kg和4w/kg),间歇式暴露模式(5min开10min关)分别建立了1800mhzrf-emf暴露条件下小鼠gc-2细胞的表观遗传学细胞研究模型。暴露72h后采用cck-8和流式细胞术等方法分析发现:不同比吸收率的1800mhzrf-emf暴露对gc-2细胞的形态、生长没有明显的影响。不同比吸收率的1800mhzrf-emf对gc-2细胞的细胞周期和凋亡也没有明显的影响(p>0.05)。(2)采用dotblot方法分析1800mhzrf-emf暴露后gc-2细胞全基因组甲基化水平,分析结果表明1w/kg和2w/kgrf-emf暴露时全基因组甲基化水平无明显变化(p>0.05),而4w/kgrf-emf暴露条件下gc-2细胞全基因组甲基化水平升高(p<0.05)。进一步的机制分析发现1800mhzrf-emf可改变dnmtsmrna和蛋白水平的表达。表明4w/kgrf-emf暴露能导致gc-2细胞dna甲基化异常改变,且DNMTs参与了4 W/kg RF-EMF诱导的全基因组甲基化水平改变调控。(3)利用DNA甲基化芯片对差异甲基化调控基因进行了筛选,发现4 W/kg RF-EMF暴露条件下,共有132个差异甲基化位点(54高甲基化和78低甲基化)。深入分析发现Cycs、Xpnpep3、Nmur2和Mob1a等基因的甲基化改变较为明显,且负调控相应基因的表达,提示我们DNA甲基化可能参与了1800 MHz RF-EMF的生物效应过程。(4)通过miRNA表达谱芯片建立了1800 MHz RF-EMF暴露条件下差异miRNA表达谱。分析结果表明4 W/kg RF-EMF暴露可以诱导miRNA差异表达。通过qRT-PCR验证和生物信息学分析发现,miR-19a-3p、miR-291b-5p、miR-7684-5p、miR-6958-3p、miR-344g-5p、miR-669n和miR-1896可能是4 W/kg RF-EMF暴露条件下主要应答miRNA。这些差异表达miRNA可能与4 W/kg RF-EMF的生物学效应密切相关。(5)通过表达谱芯片建立了4 W/kg RF-EMF暴露后全基因组表达谱。发现共511差异表达基因,其中255个基因表达上调,256个基因表达下调。Signal-Net分析发现Ugt2a1和Cyp2b10可能是重要的靶基因。通过进一步验证和信号通路分析发现,4 W/kg RF-EMF暴露条件下主要影响天然免疫反应、β干扰素细胞反应、嗅觉信号转导、神经活性的配体-受体之间的相互作用、G蛋白偶联受体等信号通路,提示RF-EMF暴露对一些基本生命活动有一定的影响。(6)我们进一步对1800 MHz RF-EMF作用机制进行了分析,结果发现4 W/kg RF-EMF暴露后与天然免疫反应有关的基因,包括IL1а、IL6、IL10、Psg19、Oas1g和Cxcl10表达水平改变明显;与嗅觉信号转导有关的基因,包括Olfr50、Olfr128、Olfr167等基因的表达水平也发生了显著的改变,表明免疫反应和嗅觉信号转导信号通路可能在4 W/kg 1800 MHz RF-EMF的生物效发挥着重要的作用,具有进一步深入研究的必要。综上所述,本实验结果表明50 Hz ELF-EMF和1800 MHz RF-EMF短期暴露都可以显著诱导DNA甲基化和miRNA差异表达,具有明显的表观遗传学效应。利用基因组学技术和生物信息学方法初步筛选和确定了两种不同频率EMFs暴露条件下的关键性应答甲基化调控基因和miRNA,建立了应答关键基因信号通路网络,表明50 Hz ELF-EMF和1800 MHz RF-EMF暴露可以通过表观遗传学调控影响免疫应激反应等信号通路从而产生生物学效应。本研究为后续EMFs的研究提供可靠依据和研究资料。