球孢白僵菌（Beauveria bassiana）属于一种昆虫病原真菌,具有持续性长、杀虫谱广以及无环境污染等优点,但它暴露在高温条件下可致其存活率降低,大大的限制了其应用,发掘其高温胁迫响应相关基因,揭示其调控机制和网络,为构建高温耐受菌株、扩大其应用具有重要意义。课题组前期研究发现,敲除F-box蛋白BbGrrA编码基因导致球孢白僵菌高温胁迫敏感的表型,其互作蛋白BbCSN5（COP9蛋白酶复合体第5亚基）通过维持BbGrrA蛋白的稳定而参与高温胁迫响应,但BbCSN5如何维持BbGrrA稳定的分子机制还不清楚,且促进BbGrrA蛋白降解的因子也有待发掘。本研究构建了BbGrrA::Myc融合基因分别转入野生型（WT）和BbCSN5突变体（ΔBbcsn5）对WT和ΔBbcsn5中BbGrrA::Myc蛋白进行纯化并进行泛素化水平检测,结果显示:BbGrrA在ΔBbcsn5中的泛素化水平显著高于WT,提示BbCSN5通过影响BbGrrA的泛素化水平进而维持BbGrrA蛋白的稳定。此外,利用酵母双杂技术从经高温胁迫后的cDNA表达文库中筛到与BbGrrA互作的蛋白BbMHK1（组氨酸激酶）,BbMHK1敲除突变体也表现出对高温敏感,进一步研究表明,敲除BbGrrA对BbMHK1的蛋白水平无显著影响,而敲除BbMHK1导致BbGrrA蛋白的磷酸化水平增高、蛋白累积,表明BbMHK1影响BbGrrA的磷酸化水平,促进BbGrrA的降解。综上,本研究揭示了BbGrrA互作蛋白BbCSN5和BbMHK1分别促进BbGrrA蛋白的稳定和降解介导球孢白僵菌高温调控的分子机制,进一步解析以BbGrrA为核心的球孢白僵响应高温的分子调控网络,为后续构建高温耐受型菌株提供了坚实的理论基础。主要研究结果如下:1.BbCSN5通过促进BbGrrA的去泛素化进而维持BbGrrA蛋白的稳定BbCSN5影响BbGrrA的修饰:为了探究BbCSN5促进BbGrrA蛋白稳定的原因;课题组构建了BbGrrA::Myc融合基因分别转入（WT）和BbCSN5突变体（ΔBbcsn5）,进行32℃高温处理不同时间,对WT和ΔBbcsn5中BbGrrA::Myc融合蛋白进行检测;发现敲除BbCSN5或高温均能导致BbGrrA蛋白的修饰增强。BbCSN5促进BbGrrA的去泛素化进而维持其稳定:因为BbCSN是一种蛋白酶复合体,其生化功能是对蛋白进行去类泛素化修饰,是泛素-蛋白酶体降解途径中的调节因子之一,因此我们推测,ΔBbcsn5敲除突变体中BbGrrA蛋白增加的修饰可能是泛素化修饰。为了验证这一推测,我们利用IP技术对WT和ΔBbcsn5中BbGrrA::Myc蛋白进行纯化并进行泛素化水平检测;发现在ΔBbcsn5菌株中BbGrrA::Myc蛋白的泛素化水平显著强于野生型。该结果表明,BbCSN5促进BbGrrA的去泛素化,维持其蛋白的稳定。ΔBbcsn5中超量表达BbGrrA可回复ΔBbcsn5高温敏感的表型:为了探究BbCSN5是否因为对BbGrrA蛋白稳定性的产生影响进而参与球孢白僵菌的高温胁迫响应,我们将BbGrrA::Myc融合基因转入ΔBbcsn5菌株中获得（ΔBbcsn5/BbGrrA::Myc）重组菌株,观察了WT、ΔBbcsn5及（ΔBbcsn5/BbGrrA::Myc）菌株在高温表型胁迫下的表型,发现在ΔBbcsn5中表达BbGrrA能回复ΔBbcsn5部分高温敏感的表型,这一结果表明,BbCSN5确实通过影响BbGrrA蛋白稳定性介导球孢白僵菌的高温胁迫响应。2.BbMHK1促进BbGrrA蛋白的降解介导球孢白僵菌高温胁迫响应BbGrrA与BbMHK可发生相互作用:为了寻找促进BbGrrA降解的蛋白,课题组利用酵母双杂技术从球孢白僵菌酵母表达的cDNA文库中筛到与BbGrrA互作的蛋白BbMHK1。BbMHK1基因全长3956bp,包含两个外显子,一个内含子,其编码全长3834bp,共编码1277个氨基酸,推测的蛋白分子量大小约为140.47k Da。BbMHK1蛋白表达受高温诱导:为了探究BbMHK1是否参与球孢白僵菌的高温胁迫响应,我们首先构建了BbMHK1::Myc基因,转入球孢白僵菌野生型中,获得（WT/BbMHK1::My）重组菌株,进一步检测了经32℃高温胁迫处理不同时间点该菌株中BbMHK1::Myc蛋白的表达,结果表明BbMHK1表达受高温诱导,提示该蛋白也有可能介导了球孢白僵菌高温胁迫响应。筛选BbMHK1敲除及其回复转化子:既然BbMHK1蛋白水平受高温诱导,为了进一步分析BbMHK1的功能,课题组构建了BbMHK1敲除及回复载体;并成功获得白僵菌敲除及回复转化子菌株。敲除BbMHK1菌株表现出对高温及氧化胁迫敏感:为了探究敲除BbMHK1其与野生型在不同胁迫下的生长差异;课题组在32℃高温、H2O2等胁迫下培养WT、ΔBbMHK1两种菌株,10d后测量其菌落直径,并计算菌落生长相对抑制率,发现BbMHK1敲除突变体后也表现出高温敏感的表型。BbMHK1促进BbGrrA蛋白的降解:为了研究BbMHK1与BbGrrA互作的机制,课题组首先将融合BbMHK1::Myc基因分别转入球孢白僵菌野生型及ΔBbGrrA菌株中,经检测发现BbMHK1蛋白水平在WT和ΔBbGrrA中无明显差异,说明BbMHK1不是BbGrrA的底物蛋白,BbGrrA并不影响BbMHK1的降解;随后我们又将融合BbGrrA::Myc基因分别转入球孢白僵菌野生型及ΔBbMHK1菌株中,当加入转录合成抑制剂处理后,（通过抑制转录从而抑制蛋白的合成）检测了上述两种菌株中BbGrrA的蛋白水平,结果发现在ΔBbMHK1中BbGrrA蛋白水平较野生型显著增多,这一结果说明BbMHK1促进BbGrrA的降解。BbGrrA存在磷酸化修饰:课题组用磷酸酶处理BbGrrA::Myc蛋白后,BbGrrA::Myc蛋白条带明显减弱,提示BbGrrA蛋白可能存在磷酸化修饰。BbMHK1间接影响BbGrrA的磷酸化修饰当用phos-tag技术检测WT和ΔBbMHK1菌株中的BbGrrA::Myc蛋白时发现,敲除BbMHK1导致BbGrrA::Myc蛋白的磷酸化修饰明显增强。结果表明,BbMHK1促进BbGrrA蛋白的去磷酸化,若BbGrrA是BbMHK1的直接底物,这一结果与BbMHK1作为激酶本身的生化功能存在矛盾,因此,BbMHK1可能通过别的蛋白磷酸化来促进BbGrrA蛋白的去磷酸化。