肾癌作为泌尿系肿瘤中最常见的三大恶性肿瘤之一,其发病率和肿瘤致死率一直位于全球男性恶性肿瘤最高发病率的前10位。最新的数据显示在美国每年新增肾癌病例约61 560例。而且相对其他肿瘤,肾癌一旦出现转移,其预后将很差。大约有三分之一的新诊断的肾癌患者在诊断时就存在转移,并且那些诊断时为局限性肾癌的患者中也有20%到40%会最终发展成转移。因此,研究肾癌的发病和转移机制,探寻影响肾癌转移密切相关的关键分子和通路,对于了解转移性肾癌的生物学特性,明确肾癌转移的分子机制,丰富转移性肾癌有效治疗手段具有极其重要的理论意义和应用价值。目的:1)研究CXCR4核定位与肾癌转移之间的关系,分析CXCR4核定位对肾癌转移的预后的影响;2)研究CXCR4配体CXCL12在CXCR4核定位过程中的作用;3)初步探讨HIF-1 alpha和CXCR4结合并促进CXCR4的机制。探究肾癌患者HIF-1 alpha表达与CXCR4核定位的相关性,并对HIF-1 alpha与肾癌预后进行分析。4)对HIF-1 alpha促进CXCR4核定位后如何诱导肾癌细胞转移的机制进行研究。方法:1)通过real-time PCR、提取肾癌细胞核蛋白、western blot、免疫荧光及免疫组化来检测肾癌细胞在CXCL12刺激前后及肾癌组织中CXCR4表达情况。2)通过PCR技术构建同义突变的EGFP-CXCR4、核定位序列突变及同义突变的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空EGFP的慢病毒,并转染病毒后建立稳定表达的肾癌细胞株。根据同义突变位点构建CXCR4 sh RNA慢病毒并转染肾癌细胞株,建立稳定敲减CXCR4的肾癌细胞株,再通过转染同义突变的EGFP-CXCR4、核定位序列突变及同义突变的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)及空EGFP的慢病毒,建立稳定rescue的肾癌细胞株,并通过荧光显微镜、real-time PCR、提取肾癌细胞核蛋白、western blot鉴定。3)通过增殖实验、侵袭实验、单克隆形成实验、凋亡实验及裸鼠皮下荷瘤实验研究稳定表达EGFP-CXCR4、核定位序列突变的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的肾癌细胞株及rescue细胞株的生物学功能情况。4)收集98例在长海医院泌尿外科住院手术的肾癌患者的病例信息,病理标本,通过免疫组化检测组织芯片中CXCR4核定位情况,研究其与临床病理参数和预后之间的关系。5)通过构建EGFP-CXCR4和p Ds Red2-CXCL12质粒并共转染293细胞,通过荧光显微镜观察CXCR4和CXCL12在细胞内相互共定位的情况。同时通过免疫组化、免疫荧光研究肾癌细胞、肾癌病灶中CXCR4、CXCL12定位情况。6)通过免疫共沉淀技术、核蛋白提取技术、western blot、免疫组化、免疫荧光研究HIF-1 alpha和CXCR4在肾癌细胞内相互作用的情况。7)通过HIF-1 alpha抑制剂、sh RNA技术及缺氧培养对肾癌细胞株进行处理,通过western blot、核蛋白抽提技术检测肾癌细胞株中CXCR4、HIF-1 alpha的表达情况及核定位情况。8)通过免疫组化检测组织芯片中HIF-1 alpha核定位及表达情况,研究其与临床病理参数和预后之间的关系。9)通过免疫组化、western blot技术研究肾癌细胞株及肾癌病灶中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相关的蛋白表达情况,研究CXCR4核定位对肾癌细胞EMT的影响。10)通过提取肾癌细胞核蛋白、western blot等技术研究稳定表达EGFP-CXCR4、核定位序列突变的EGFP-CXCR4(NLSmut-CXCR4)、空EGFP的肾癌细胞株中Vimentin、E-cadherin、CD44等EMT相关的蛋白表达情况,研究CXCR4核定位对肾癌细胞EMT的影响。11)通过HIF-1 alpha抑制剂、缺氧培养、CXCL12对肾癌细胞株进行处理,通过western blot、核蛋白抽提技术检测HIF-1核定位和CXCR4核定位诱导肾癌侵袭的机制。结果:1).经过CXCL12刺激后肾癌细胞株ACHN中核蛋白中CXCR4蛋白逐渐增加,并在刺激24小时内随着时间延长CXCR4在核蛋白中的浓度逐渐增加。经过CXCL12刺激后肾癌细胞中CXCR4蛋白在核内表达。部分肾癌原发灶中CXCR4在细胞核内有表达,部分肾癌原发灶中CXCR4仅在细胞浆或及细胞膜上表达,而在肾癌转移灶中CXCR4在细胞核内表达。2).对CXCR4的c DNA序列中709-726的碱基进行同义突变,将709-726的碱基序列GCCCTCAAGACCACAGTC变成GCTCTGAAAACAACCGTG,氨基酸序列均为ALKTTV。再在CXCR4同义突变的基础上将氨基酸序列146-RPRK-149突变为AAAA,即将436-447碱基AGGCCAAGGAAG突变成GCCGCTGCCGCT。将突变后的CXCR4装入慢病毒载体,测序明确突变符合要求。诊断CXCR4原709-726的碱基序列GCCCTCAAGACCACAGTC进行设计sh RNA干扰,序列如下:CCGGCCCTCAAGACCACAGTCATTTCAAGAGAATGACTGTGGTCTTGAGGGTTTTTTG。并装入sh RNA表达慢病毒。将慢病毒转染肾癌细胞株ACHN,并筛选成稳定细胞株。real-time PCR结果显示在EGFP-CXCR4或NLS-CXCR4过表达组中CXCR4m RNA表达明显升高。荧光显微镜下确认稳定表达的细胞株中的荧光表达,EGFP-CXCR4蛋白在细胞膜、细胞浆及细胞核内均有表达,而NLS-CXCR4蛋白在细胞膜、细胞浆内表达。抽提细胞核蛋白进行蛋白电泳结果发现:EGFP-CXCR4蛋白在核内有表达,而NLS-CXCR4蛋白在核内无表达。3).增殖实验结果显示:从第三天开始,EGFP-CXCR4组和EGFP组相比具有统计学差异,而从第四天开始,NLS-CXCR4组和EGFP组相比具有统计学差异(p<0.05)。侵袭实验结果显示:EGFP-CXCR4组OD值最高,EGFP-CXCR4组和NLS-CXCR4组有统计学差异,EGFP-CXCR4组和空EGFP组及ACHN对照组有统计学差异(p<0.05)。NLS-CXCR4组和空EGFP组未见明显统计学差异(p<0.05)。单克隆形成实验结果显示:EGFP-CXCR4组形成的克隆数最多,NLS-CXCR4组其次,而空EGFP组和ACHN对照组最少。EGFP-CXCR4组和EGFP组相比有统计学差异(p<0.05),NLS-CXCR4组和EGFP组相比有统计学差异(p<0.05),EGFP-CXCR4组和NLS-CXCR4组相比有明显统计学差异(p<0.05)。流式检测凋亡结果显示过表达空EGFP的ACHN细胞、过表达EGFP-CXCR4的ACHN细胞及过表达NLS-CXCR4的ACHN细胞的凋亡水平分别为:14.8%、5.33%和5.28%。显示核定位突变的组凋亡有所下降。裸鼠皮下荷瘤实验结果显示,皮下移植肾癌细胞14天后起,EGFP-CXCR4组移植瘤和EGFP组有统计学差异,而EGFP-CXCR4组移植瘤和NLS-CXCR4组无统计学差异,NLS-CXCR4组和EGFP组无统计学差异。4).组织芯片显示:CXCR4在肾癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,其中出现CXCR4核定位的占所有肾癌标本中的64.7%。在肾癌患者单因素生存分析中发现:CXCR4核定位组预后明显差于CXCR4阴性组及CXCR4胞浆表达组。肾癌癌组织中CXCR4的表达水平与性别、年龄、症状、肿瘤直径大小、肿瘤位置、T分期、N分期、M分期、AJCC肾癌分期、病理类型、Fuhrman分级均无关。5).通过DNA测序证实构建p EGFP-CXCR4、p Ds Red2-CXCL12质粒成功。荧光显微镜下观察通过lipofectamin 3000共转染p EGFP-CXCR4、p Ds Red2-CXCL12质粒入293细胞,发现红色荧光和绿色荧光均表达,且在部分293细胞中共同表达,形成黄色荧光。荧光显微镜下观察经CXCL12刺激24小时后的肾癌细胞株,发现:CXCR4在细胞核内及细胞浆有表达、CXCL12在细胞浆表达,CXCL12未在细胞核内表达。6).免疫组化发现:CXCR4核定位阳性的肾癌病灶中HIF-1 alpha核定位阳性。免疫荧光显示:CXCL12刺激24h后HIF-1 alpha在细胞核内有表达。通过GFP-Trap试剂盒分别对高表达空EGFP、EGFP-CXCR4、NLS-CXCR4的肾癌细胞进行pulldown免疫共沉淀,并进一步进行western blot,发现HIF-1 alpha在EGFP-CXCR4组及NLS-CXCR4组有表达,而在空EGFP组无表达。7).western blot实验发现:HIF-1 alpha抑制剂处理后HIF-1 alpha在肾癌细胞核内表达明显减少,CXCR4在肾癌细胞核内表达也明显减少。在肾癌细胞缺氧培养后HIF-1 alpha表达明显升高。8).组织芯片显示:HIF-1 alpha在肾癌的表达情况和肾癌患者预后成负相关,且HIF-1 alpha核定位组的肾癌患者预后最差。HIF-1 alpha表达和肾癌灶的细胞增殖水平、肿瘤直径大小、病理类型明显相关(p<0.05)。HIF-1 alpha表达水平与肾癌患者的年龄、性别、肿瘤的位置、Fuhrman分级、TNM分期等无明显相关(p>0.05)。HIF-1 alpha核定位和CXCR4核定位表达存在相关性,具有统计学差异(p<0.05)。9).免疫组化结果发现:相对于CXCR4核定位阴性组,CXCR4核定位阳性的肾癌灶中Vimentin、caspase-3水平低表达,E-cadherin水平高表达,CD44高表达,NF-kappa B高表达,PCNA高表达,Ki-67、CD105高表达。Western blot结果显示:在缺氧诱导下,肾癌细胞中HIF-1 alpha表达增加,CXCR4核定位增加,E-cadherin表达增高、Vimentin表达降低、CD44表达增加。CXCL12刺激后肾癌细胞中E-cadherin的m RNA表达增加,Vimentin基因表达减少,且能被CXCR4受体拮抗剂AMD3100所抑制。CXCL12及缺氧可以增加肾癌细胞侵袭能力,AMD3100及HIF-1 alpha抑制剂可以抑制肾癌细胞的侵袭能力。结论:1)CXCL12和肾癌细胞的CXCR4结合后促进了CXCR4蛋白的核转位。肾癌原发灶中部分患者出现CXCR4核定位,肾癌转移灶中CXCR4核定位明显。肾癌灶中CXCR4核定位与患者症状、肿瘤TNM分期、增殖水平、病人复发转移等明显相关,预示肾癌复发、转移风险增加,预后不良。2)CXCR4核定位序列为146-RPRK-149,将其突变后的CXCR4蛋白无法在细胞核内表达。CXCR4核定位缺失后增殖、侵袭、单克隆形成、裸鼠皮下成瘤能力能力明显下降。CXCL12在和CXCR4结合后可能形成复合体进入细胞浆。CXCL12未在细胞核内表达。3)HIF-1 alpha在细胞浆内和CXCR4相互作用,可能参与了CXCR4的核定位。HIF-1 alpha核定位出现在部分肾癌原发灶中,肾癌灶中HIF-1 alpha核定位与患者症状、肿瘤TNM分期、增殖水平、病人复发转移等明显相关,预示肾癌复发、转移风险增加,预后不良。4)HIF-1 alpha作为CXCR4入核过程中的重要靶点蛋白和CXCR4结合,是缺氧环境下促进肾癌细胞CXCR4核定位的重要机制。5)CXCL12刺激肾癌细胞后,HIF-1 alpha和CXCR4相互作用,进入细胞核内,可能通过EMT信号通路导致肾癌转移。在肾癌转移的EMT信号通路中,CXCL12/HIF-1 alpha/CXCR4通路具有重要作用,并在肾癌原发灶和转移灶中得到证实。