本研究以鼠白血病病毒的gag蛋白替换禽流感病毒的M1蛋白,利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备了一种将H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白,以及H3N2亚型禽流感病毒的HA蛋白共同嵌合到gag蛋白上,以此构建二价嵌合禽流感病毒样颗粒,旨在获得同时诱导H9N2和H3N2亚型禽流感病毒特异性免疫的疫苗。具体构建过程为:首先构建p Fast Bac1-H9、p Fast Bac1-H3和p Fast Bac1-Mgag N2三种重组穿梭质粒,然后将其分别转化至E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得三种重组杆粒,即r Bacmid-H9、r Bacmid-H3和r Bacmid-Mgag N2。然后,将三种重组杆粒分别感染Sf9贴壁细胞,96h后收取P1代杆状病毒,盲传3代后获得P4代杆状病毒,即r BV-H9、r BV-H3和r BV-Bgag N2。测定P4代杆状病毒滴度后,将三种杆状病毒以MOI=3的感染剂量共感染Sf9悬浮细胞。96 h后将收取的细胞上清经20%-30%-60%蔗糖密度梯度离心纯化。血凝结果显示,该病毒样颗粒的血凝效价为28;western blot鉴定结果表明,其能够正确表达目的蛋白;在透射电镜下,所获得的病毒样颗粒粒子直径约为180 nm,表面嵌有纤突。由此表明,四种蛋白成功组装成了二价嵌合病毒样颗粒（bivalent chimeric virus-like particles,bc VLPs）。为了验证所制备的bc VLPs的免疫效果,对免疫鸡只进行了HI抗体效价测定和脾淋巴细胞增殖能力检测。HI抗体效价测定结果表明,免疫后三周内各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价呈上升趋势,即使免疫后第35天,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的HI抗体效价仍高于2log2,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的HI与疫苗免疫组无显著差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs具有较强的免疫原性,免疫后能诱导机体产生良好的体液免疫。脾淋巴细胞增殖能力检测结果表明,各剂量bc VLPs免疫组和疫苗免疫组的SI随着时间延长而增长,到免疫后第3周达到高峰,并且高剂量bc VLPs免疫组与疫苗免疫组对比显示,高剂量bc VLPs免疫组各时间点的SI与疫苗免疫组无显著差异（p>0.05）。由此表明bc VLPs能诱导机体产生良好的细胞免疫。为了评价本研究制备的二价嵌合病毒样颗粒bc VLPs的保护效力,于免疫三周后用H9N2和H3N2亚型AIV进行滴鼻攻毒。体外排毒和体内载毒检测结果表明,高剂量和中剂量bc VLPs免疫组攻毒后,病毒的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组,而低剂量bc VLPs免疫攻毒组的体外排毒时间和体内载毒时间短于疫苗免疫攻毒组或与疫苗免疫攻毒组的时间相当。此外,IHC方法检测抗原试验结果表明,免疫攻毒后第7天,低剂量免疫攻毒组和疫苗免疫攻毒组鸡只的肺脏和气管已检测不到病毒,而攻毒对照组鸡只的肺脏和气管中仍能检测到病毒。由此表明,bc VLPs免疫攻毒组体外排毒时间更短、体内病毒载量更低,因此bc VLPs疫苗能够更好地阻止病毒复制,有效地保护鸡只免受病毒的攻击。总之,本研究制备的bc VLPs能够诱导鸡只产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,可以有效保护鸡只免受同源病毒的攻击,为新型二价AIV疫苗的研制提供了新的疫苗制备策略。