论文部分内容阅读
本文对不同日龄WZSP（wuzhishan porcine五指山猪）近交系睾丸内的SSCs（spermatogonial stem cells精原干细胞）和Lc（Leydig cells间质细胞）进行体外分离、培养实验,采用曲精细管组织培养法,借助相差显微镜观察,对不同日龄猪的睾丸组织采用不同的方法处理,还对睾丸内混合细胞和Lc进行了冷冻实验,研究确定了SSCs和Lc进行体外分离和培养的最佳日龄,总结出一套WZSP近交系精原细胞和睾丸间质细胞分离培养的简单方法,可为将来SSCs及Lc的建系和深入研究提供技术参考。实验分三个部分:（1） WZSP精原干细胞体外分离、培养研究。（2） 猪睾丸内混合细胞冷冻实验。（3） 猪睾丸间质细胞体外分离、培养研究。实验结果表明:体外培养精原干细胞的最佳时限为1-20日龄,此时,睾丸内细胞类型较少,精原干细胞、间质细胞、支持细胞区分明显;对1-8日龄仔猪睾丸胰蛋白酶消化法,对2周龄左右采用组合酶消化法,以DMEM为基础培养基,添加不同营养成分,在34℃,5%CO2饱和湿度条件下,原代精原干细胞在培养7-8d后开始出现集落,SSCs集落在培养皿中悬浮或半悬浮生长,仅有少量SSCs细胞贴于培养皿;对SSCs集落进行AKP染色处理,结果显示:SSCs集落为强阳性,其他细胞不着色;采用曲精细管组织培养法,也可对精原干细胞进行成功的培养,SSCs集落在培养5d后出现。猪精原干细胞在小鼠成纤维饲养层上传代结果显示:SSCs集落和SSCs单细胞在小鼠成纤维饲养层上贴壁性能良好,但维持时间不长,不能在小鼠成纤维饲养层上长期培养;猪睾丸成熟间质细胞在仔猪出生后8天左右开始出现,2周龄左右间质细胞数量达到高峰,为体外分离、培养间质细胞的最佳时间;对2周龄左右仔猪采用机械吹打法和胶原酶消化法均可获得较高纯度的间质细胞,纯度可达90%以上;通过实验发现间质细胞需在不涂明胶的培养瓶或培养皿上进行培养,涂有明胶对间质细胞贴壁有显著影响。另外,猪睾丸间质细胞按猪胚胎成纤维细胞冷冻液配方和冷冻程序进行冷冻,经解冻后,间质细胞的活率较高,贴壁率可达90%以上。因此,猪胚胎成纤维细胞冷冻液配方和冷冻程序适合睾丸间质细胞的冷冻,但并不适合睾丸内混合细胞的冷冻保存;睾丸组织在（4℃）PBS液中存放24h后,仍可作为体外分离和培养精原干细胞及间质细胞的材料。