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移植排斥反应实质上是受体免疫系统对供体移植物抗原的免疫应答,是T淋巴细胞依赖的细胞性反应过程。但器官移植后受体的免疫系统并不能直接识别供体抗原,供体抗原信息必须经过抗原提呈细胞传递给受体T淋巴细胞使之活化才能产生后续的免疫应答。树突状细胞(Dendritic cells, DCs)是功能最强的抗原递呈细胞,唯有DCs才能有效激活初始T细胞,其在体内递呈抗原的过程是一个动态的迁移过程,携带抗原信息的DCs从外周迁移到淋巴组织的T细胞区完成抗原递呈并激活初始T细胞。目前认为外周DCs向淋巴组织的迁移动力主要通过淋巴组织趋化因子作用于DCs趋化因子受体CCR7这条途径。因此,CCR7成为一个理想的目标。肽核酸(peptide nucleic acid ,PNA)是一种新型的核酸类似物,由多肽骨架替代核酸中的磷酸核糖骨架并与4种碱基相连而成,能够按照碱基互补的原则识别相应的碱基序列。PNA较寡核苷酸链具有更高的特异性和亲和力,不易被蛋白酶及核酸酶降解,而且对机体无毒,从而成为更有前途的反义反基因制剂。目的(1)通过建立大鼠原位肝移植急性排斥和免疫耐受动物模型,观察两组大鼠肝移植后体内DCs的迁移动态变化并对其在移植排斥中的作用进行探讨。(2)设计靶向趋化因子受体CCR7的反义PNA,分离、培养大鼠骨髓来源DCs,在体外观察反义PNA对CCR7基因表达的下调作用及其对DCs趋化活性和凋亡的影响。(3)在上述动物模型和体外实验的基础上,进一步研究体内应用反义PNA对大鼠肝移植急性排斥反应的影响,并对其可能机制进行探讨。通过以上三部分实验,来阐明大鼠肝移植后DCs的迁移特征及其在移植排斥反应中的作用,应用反义PNA下调CCR7基因表达,阻断DCs的定向迁移和抗原递呈,切断抗原信息与免疫系统的联系,从而为抑制移植排斥反应和诱导免疫耐受提供一种新的策略。方法(1)采用改良Kamada两袖套法建立大鼠原位肝移植模型,分为两组:急性排斥组,供体为Wistar大鼠,受体为SD大鼠;免疫耐受组,供受体同为Wistar大鼠。于术后第3、5、7天切取移植肝组织及腹腔淋巴结(n=4),依据肝脏病理学变化诊断肝移植术后急性排斥反应,免疫组织化学染色法检测DCs在肝组织、淋巴结的动态变化以及T细胞在淋巴结的活化增殖。(2)体外培养大鼠骨髓来源DCs,设计靶向CCR7 mRNA翻译起始区的反义PNA,以随机PNA、空白组为对照处理DCs,分别于24h,48h, 72h后收集细胞,利用免疫细胞化学法、Western blotting和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测反义PNA对CCR7分子表达的影响,通过趋化实验和流式细胞术检测DCs的趋化活性和凋亡率。(3)同上方法建立大鼠肝移植排斥模型,在供肝冷保存时和肝移植术后应用反义PNA,以随机PNA、空白组为对照,观察大鼠术后生存时间。于术后第7、10天取标本(n=4)观察肝功能变化和肝脏组织病理学改变,免疫组化染色法检测淋巴结DCs数量变化以及T细胞的活化增殖。结果(1)急性排斥组大鼠术后第5天出现典型的急性排斥反应表现和肝组织病理学改变,免疫耐受组大鼠术后无明显排斥反应表现,肝组织仅发生轻微的形态学变化。急性排斥组大鼠肝组织DCs数量在术后第3天明显增多,于第5天达到高峰,第7天则出现下降,淋巴结DCs数量从第3天开始明显增多,第5天、7天持续上升,与免疫耐受组相比差异有显著性。急性排斥组术后第3天即可观察到明显的T淋巴细胞活化增值反应,先于肝组织病理学变化发生,而免疫耐受组未见明显的T淋巴细胞活化增殖。(2)体外培养的大鼠骨髓来源DCs经PNA处理后,在24h,各组DCs其CCR7表达无明显差别。在48h,反义PNA组CCR7蛋白表达水平明显低于对照组,而在mRNA水平却无明显差别。在72h,反义PNA组CCR7的表达在不同水平均明显低于对照组。趋化实验和流式细胞术结果显示,在48h以后反义PNA组DCs趋化活性受到明显抑制,凋亡率明显增加。(3)大鼠肝移植术后,反义PNA组与随机PNA、空白组相比淋巴结DCs数量明显减少,T细胞活化增殖受到显著抑制,术后移植排斥反应延迟,受体生存时间明显延长。结论(1)Wistar→SD大鼠的肝移植组合是高排斥组合,而Wistar→Wistar的组合则无排斥,表现为免疫耐受。排斥组合大鼠肝移植术后,DCs的迁移动力学发生显著变化,主要表现在抗原摄取和递呈加速,形成大量DCs向淋巴结抗原递呈区的迁移和积聚,从而对T细胞产生强烈而持久的刺激,最终激活T细胞导致移植排斥反应发生。这使我们有理由相信,通过阻断DCs迁移,使抗原递呈过程不能发生,从而切断抗原信息与免疫系统的联系,可能达到抑制排斥反应的目的;或者将迁移DCs的数量和速度控制在一定的低量状态,有可能诱导免疫耐受。(2)在体外试验,靶向趋化因子受体CCR7的反义PNA显著下调DCs CCR7基因表达,不仅明显抑制DCs的趋化活性而且还可以诱导其发生凋亡。(3)在体内试验,通过反义PNA下调CCR7基因表达,阻断DCs迁移和抗原递呈,能有效抑制急性排斥反应,延长受体存活时间,尽管并没有使移植物达到长期存活和诱导免疫耐受,但是利用反义制剂阻断DCs的迁移和抗原递呈以达到抑制移植排斥反应,可能较目前所使用的免疫抑制方法更具选择性和安全性。