中医在治疗痹证疼痛方面拥有悠久的历史和丰富的经验,而对不同痹证疼痛的治疗方法也有所区别。本实验采用完全弗氏佐剂所致的大鼠痹证疼痛模型,同时在痹证模型基础上引入寒凉和湿热因素,并结合传统中药宽筋藤干预,分析中医对不同痹证疼痛的治疗效果并对其中枢敏化层面上的镇痛机制评价,体现中医辨证施治的意义。1.宽筋藤抗炎镇疼痛作用的研究目的:探究宽筋藤镇痛抗炎作用的机制,并分析其作用机制。方法:将大鼠按随机数字法分为7组,即正常组、模型组、泼尼松组、宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤醇提物1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外其余各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模,各组于造模后24h开始第一次灌胃给药,1次/天,共灌胃12天。第一次给药2h后进行体重、50%机械缩足痛反应值、热缩足反应时间及患足足跖肿胀率的测定,之后每间隔一天进行测定。给药12天后灌注取材,制作脊髓免疫组化切片,观察NMDA受体的表达情况。并取血清,酶联免疫分析法(ELISA)检测血清IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α的含量。结果:①足肿胀率:造模后模型动物肿胀率显著增加(与对照组相比较P<0.01),且肿胀程度在造模后第3天达到峰值。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在造模后第1、3天可明显降低大鼠足跖的肿胀程度(与模型组相比较P<0.01),且宽筋藤水提物1.2g/kg,醇提物2.4g/kg在其余各时间点其大鼠足肿胀率均明显低于模型组大鼠(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。②热缩足反应时间:造模后模型动物患足热缩足反应时间明显缩短(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低值。宽筋藤水提物1.2g/kg、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg在造模后12d内均可显著延长大鼠热缩足痛反应时间(与模型组相比较P<0.01)。③50%机械缩足反应值:造模后模型动物患足50%机械缩足反应值显著降低(与对照组相比较P<0.01),且在造模后第3天达到最低点。宽筋藤水提物、醇提物各剂量在给药1h后即可显著增加动物50%机械缩足反应值(与模型组相比较P<0.01),造模后12d内可显著增加大鼠50%机械缩足反应(与模型组相比较P<0.01)。④炎性细胞因子:模型大鼠血清炎症细胞因子IL-1α、TNF-α、IL-6含量显著增加(与正常组比较P<0.05,P<0.01),IL-10含量显著降低(与正常组比较P<0.05,P<0.01)。给药12d后,宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显著降低模型大鼠血清IL-1α、TNF-α、IL-6含量并升高模型大鼠IL-10含量(与模型组比较P<0.05,P<0.01),对炎性疼痛有一定的治疗作用。⑤脊髓中NMDA受体表达量:造模后,炎性疼痛模型大鼠损伤侧的脊髓背角中NMDA受体表达显著增加(与正常组比较P<0.01)。宽筋藤水提物1.2g、2.4g/kg,宽筋藤醇提物1.2g、2.4g/kg均可显著抑制炎性疼痛模型大鼠患侧脊髓中NMDA受体表达量的增加(与模型组比较P<0.01)。结论:宽筋藤水提物、醇提物均可有效抑制炎性疼痛模型大鼠对于温度和机械性刺激敏感性的升高;宽筋藤的镇痛抗炎机制与其降低外周炎症因子和抑制脊髓背角NMDA受体的表达有关;宽筋藤的水提物和醇提物镇痛抗炎效果基本相同,故后续试验采用宽筋藤水提物。2宽筋藤对寒痹、热痹大鼠痛觉敏感干预作用的研究目的:观察宽筋藤对寒痹、热痹模型大鼠痛觉过敏的干预作用及其作用的差异;并从痛觉的中枢敏化角度分析其作用原理。方法:将大鼠按随机数字法分为11组,即正常组、模型组、布洛芬组、热痹模型组、寒痹模型组、宽筋藤热痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组、宽筋藤寒痹模型0.6g/kg、1.2g/kg、2.4g/kg组。除对照组外,各组大鼠足跖部皮内注射完全弗氏佐剂造模后第二天,将寒热痹症各模型及给药组分别放入恒温气候箱中4h,造模持续14d。各给药组于足底造模后24h开始第一次灌胃给药14d。造模前及造模后3d、7d、10d、14d分别进行50%机械痛反应值、热缩足反应时间指标的测定。在末次给药后一天对每组六只灌注取材,制作脊髓和患侧背根神经节的免疫组化切片,观察CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体指标的表达情况。末次给药后对大鼠进行取材,每组剩余六只大鼠麻醉后取新鲜的脊髓放入冻存管中迅速冷冻。蛋白质印迹法测定大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1和NMDAR的表达情况。结果:①热缩足反应时间:模型大鼠热缩足反应时间显著降低(与同组基础值相比较P<0.01),且于造模后第7天达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素后,可不同程度的延长大鼠热缩足反应时间,其中寒凉因素的影响效果更明显。宽筋藤各剂量组可不同程度延长热痹模型大鼠患足的热缩足反应时间,其中宽筋藤2.4g/kg在给药后第14天,宽筋藤1.2g/kg在给药后第7、10、14天,宽筋藤0.6g/kg在给药后第7天作用明显(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤各剂量组可不同程度降低寒痹模型大鼠对温度刺激的敏感性。②50%机械缩足反应值:模型大鼠50%机械痛反应值显著降低(与同组基础值相比较P<0.01)。模型组大鼠在造模后各时间点患足50%机械痛反应值均明显低于对照组(与对照组相比较P<0.01),且于造模后第7天50%机械痛反应值达到最低,在造模后第14天未见明显恢复。引入寒凉、湿热因素14d后,均可不同程度的升高大鼠患足对机械刺激的敏感性,其中寒凉因素的影响更显著(与模型组相比较P<0.01)。宽筋藤各剂量组可不同程度提高热痹模型大鼠的50%机械痛反应值,其中宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续抑制热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与热痹模型组相比较P<0.05,P<0.01);宽筋藤2.4g/kg在给药14d内可持续促进热痹模型大鼠50%机械痛反应值的升高(与寒痹模型组相比较P<0.05,P<0.01)。③蛋白质印迹法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白表达显著升高(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可显著增加模型大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDAR的表达(与模型组相比较P<0.05),其中湿热因素的效果更明显。给予宽筋藤水提物之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显著减少(与模型组相比较P<0.01)。④免疫组织化学法测定脊髓中通路表达量:模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体表达显著增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠脊髓中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDAR表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各模型组及热痹模型组大鼠脊髓中CX3CR1、CX3CL1、NMDA趋化因子及其受体蛋白的表达显著减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。⑤免疫组织化学法测定患侧背根神经节中通路表达量:模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA趋化因子及其相关受体蛋白的表达显著增加(与对照组相比较P<0.01)。寒凉因素和湿热因素的引入均可增加模型大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、N]MDAR的表达,其中寒凉因素的效果更明显。灌胃给药宽筋藤水提物各剂量之后,各热痹模型组大鼠患侧背根神经节中CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA受体蛋白的表达显著减少(与模型组相比较P<0.05,P<0.01)。结论:寒凉和湿热因素均可不同程度的加强痹症模型大鼠痛觉敏感程度;宽筋藤水提物可有效减轻热痹疼痛模型大鼠痛觉敏感程度,而对寒痹疼痛模型大鼠的痛觉敏感有一定程度的加强作用;宽筋藤在中枢敏化层面上的镇痛机制与其有效的抑制CD11b、CX3CL1、CX3CR1、NMDA几种趋化因子及其受体蛋白的表达有关。