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嫩度是肉类非常重要的感官特性,大部分消费者将其作为评判肉类质量最重要的标准之一。因此,研究清楚影响肉类嫩度的因素,将能更好地帮助肉类生产商可以提供嫩度优良的肉,从而为了更好地满足消费者的要求。肌肉的组成非常复杂,而且动物宰后有多种因素相互作用,所以成熟是一个肌肉化学成分和组织结构剧烈变化的复杂过程。普遍认为,肉类嫩化是由于内源性蛋白水解酶削弱了肌原纤维蛋白的结构和水解了相关蛋白。一般认为钙蛋白酶μ-calpain和m-calpain在宰后非生理条件下可以作用于肌原纤维蛋白。这两种钙蛋白酶共同被其内源性特异性的抑制剂calpastatin所调解。畜禽在被屠宰以后,动物体的肌细胞会出现缺氧、大量失血的情况,此种情况与正常机体的细胞在面对外界不利因素时的情况极为相似。在这些不利因素的作用下,机体为了保护自身不可避免的出现“细胞凋亡”这种主动的程序化死亡过程。而细胞内caspase-3是细胞凋亡中,最重要的一种凋亡关键酶。由于畜禽宰后成熟与“细胞凋亡’过程的相似性,所以caspase-3是否在成熟过程中起作用,成为近来肉成熟理论的研究热点。具体研究内容和结果如下：1.诱导凋亡对宰后鸡肉成熟过程中的caspase-3和肌原纤维的影响本研究旨在探索细胞凋亡关键蛋白酶caspase-3与肉类嫩化机制之间的关系,利用细胞凋亡诱导剂喜树碱,依托泊苷和钙离子以及低频高强度超声(40kHz,1500W)处理屠宰后成熟过程中的鸡肉,发现三种诱导剂和超声波处理使caspase-3的活性显著高于对照组(p<0.05),并且钙离子和超声处理使caspase-3的特异性底物a-spectrin产生特殊的120kDa的激活条带(p<0.01)。SDS-PAGE结果显示诱导凋亡处理后30 kD的Troponin-T降解片段条带强度明显高于对照组(p<0.01)。电镜观察发现三个细胞凋亡诱导剂和超声波处理在鸡肉成熟中的前3天能显著提高肌原纤维的水解。本研究表明,细胞凋亡关键蛋白酶家族caspase-3与肉类嫩化存在一定的关联性。2.诱导凋亡对宰后鸡肉成熟过程中钙蛋白酶的影响及出现的凋亡现象本章研究了细胞凋亡诱导剂喜树碱,依托泊苷和低频高强度超声(40kHz,1500W)处理宰后成熟过程中的鸡肉,发现三种诱导剂处理显著提高了免疫印迹中钙蛋白酶calpain条带的强度(p<0.05),同时降低了calpastatin条带的强度(p<0.05)。低频高强度超声(40kHz,1500W)处理宰后鸡肉30分钟或60分钟显著提高了钙蛋白酶的活性(p<0.01),同时也降低了calpastatin条带的强度(p<0.01)。这些研究表明caspase-3通过降低calpain的抑制剂calpastatin上调calpain,进而在鸡肉的成熟过程中发挥作用。并且,在鸡肉的宰后成熟过程中,肌细胞的细胞核出现了凋亡过程中细胞核典型的浓缩现象,同时线粒体发生了显著的破损情况,而诱导凋亡处理使这种现象更加的剧烈。同时,诱导剂和低频高强度超声处理组的ATP、ADP、AMP含量显著低于对照组(p<0.05),但是,诱导剂和低频高强度超声处理组在前24小时Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性显著地高于对照组,而24小时后除了钙离子处理组的Na+K+-ATPase活性,其他诱导剂处理和超声波处理都显著降低了Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性(p<0.05)。说明宰后诱导凋亡处理发生细胞凋亡的过程引起了肌细胞能量的减少,并且在前24小时,由于细胞内大量的离子交换过程导致Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的升高。凋亡关键蛋白酶家族蛋白酶caspase-3是通过细胞凋亡过程参与鸡肉的成熟。3.鸡肉成熟过程中caspase-3抑制剂对calpain的影响本章利用细胞凋亡关键酶caspase-3的抑制剂DEVD-CHO和Z-VAD-FMK处理宰后成熟过程中的鸡肉,发现DEVD-CHO处理使钙蛋白酶calpain的活性显著低于对照组(p<0.01),同时显著降低了免疫印迹中calpain条带的强度(p<0.05),而提高了calpastatin条带的强度(p<0.05)。这些研究结果表明caspase-3通过降解calpastatin激活了钙蛋白酶。本研究表明,caspase-3通过calpain/calpastatin系统,在肉类成熟过程中促进嫩化,并且细胞凋亡关键蛋白酶家族caspases与肉类嫩化存在一定的关联性。相反,Z-VAD-FMK处理组使钙蛋白酶calpain的活性显著高于对照组(p<0.01)。Z-VAD-FMK处理组显著提高了免疫印迹中calpain条带的强度(p<0.05),而降低了calpastatin条带的强度(p<0.05)。通过caspase-3的免疫印迹实验发现,Z-VAD-FMK处理对caspase-3基本没有影响。并且,caspase-3的抑制剂DEVD-CHO和Z-VAD-FMK处理组的ATP、ADP、AMP含量显著高于对照组(p<0.05),同时提高了Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性(p<0.05)。说明宰后caspase-3的抑制剂DEVD-CHO和Z-VAD-FMK减少了细胞凋亡发生的条件,凋亡关键蛋白酶家族蛋白酶caspase-3是通过细胞凋亡过程参与鸡肉的成熟。传统理论认为钙蛋白酶calpain是骨骼肌嫩化过程中最重要的一种内源性蛋白酶。而caspase-3和calpain这两种酶在宰后肉的成熟嫩化过程中的相互作用。4.鸡肉成熟过程中calpain抑制剂对caspase-3的影响传统理论认为calpain是骨骼肌嫩化过程中最重要的一种内源性蛋白酶。本章研究旨在探索宰后成熟过程中的鸡肉中calpain对细胞凋亡关键蛋白酶caspase-3的影响。利用calpain的抑制剂MDL28170和calpeptin处理屠宰后成熟过程中的鸡肉,发现处理使caspase-3的活性显著高于对照组(p<0.01),并且使caspase-3的特异性底物a-spectrin产生特殊的120kDa的激活条带(p<0.01)。另外,各种处理显著提高了免疫印迹中calpastatin条带的强度(p<0.05)。这些研究结果表明抑制Calpain的结果导致calpastatin的过表达,进而上调caspase-3的活性。同时研究了calpain的抑制剂MDL28170和calpeptin处理对宰后成熟过程中的鸡肉中能量代谢的影响。发现两个抑制剂处理组ATP、ADP、AMP含量都显著高于对照组(p<0.05)。并且Na+K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性也高于对照组(p<0.05)。说明在成熟过程中,calpain对细胞凋亡关键蛋白酶caspase-3的影响是在细胞凋亡过程中完成的。并且细胞凋亡关键蛋白酶家族caspases在肉类成熟过程中促进嫩化是由calpain调节的。