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稻瘟病是水稻上重要的病害之一,其病原菌为子囊菌Magnaporthegrisea。了解M.grisea的致病机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统,对于了解其它真菌的致病机理也有重要意义。致病相关基因的克隆和分析是达到这一目标的有效途径。本文克隆了在稻瘟病菌中致病相关基因MgS11、MgATG5和MgATG8,并通过与GFP蛋白的融合研究了MgS11和MgATG5基因的表达,通过基因取代的方法分析了MgS11、MgATG5和MgATG8基因在稻瘟病菌致病性及其他相关过程的作用。具体研究结果如下:
1.利用稻瘟病菌附着胞cDNA文库,在文库中找到一条S11基因,定名为MgS11;利用酵母中ATG5和ATG8基因序列,在稻瘟病菌中找到同源基因,定名为MgATG5和MgATG8。通过PCR获得了这些基因的cDNA全长,并进行序列分析。
2.通过构建MgS11、MgATG5和MgATG8基因置换载体和敲除转化,得到Knock-out突变子。通过PCR和Southern杂交分析各鉴定出1个Knock-out突变子,明确MgS11、MgATG5和MgATG8在Guy11菌株中均为单拷贝。
3.△MgS11突变子的菌落形态与野生型不同,生长速度无明显改变。在N饥饿,C饥饿,高渗(1MNaCl)胁迫条件下的菌落形态,生长速度与野生型比较无明显差异。△MgS11突变子的产孢能力均大幅度降低。△MgS11突变子的疏水性测定表明,MgS11基因影响了稻瘟病菌的疏水性。
4.构建PHNS11E、PHNES11和PHS11PE荧光蛋白表达载体,转化至稻瘟病菌原生质体。结果表明:MgS11基因在稻瘟病菌菌丝尖端、分生孢子及成熟的附着胞中均有不同程度的表达,其中,孢子和附着胞中的表达量相对较高。
5.△MgATG5突变子的菌落形态与野生型不同,生长速度和野生型没有差别,产孢能力下降,萌发速度与野生型相比明显减缓。△MgATG5突变子对大麦的致病力比野生型大大下降。
6.通过构建原核表达载体,进行基因的原核表达测试。结果显示MgATG5在胞内高效表达。
7.△MgATG8突变子产孢量降低。