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镉(Cd)是动植物非必需元素,被认为是毒性最强的重金属之一。土壤中过量的重金属不仅影响作物的产量和品质,还可以经食物链危害人体的健康。增强植物重金属耐性和降低植物体内重金属积累能够减轻重金属污染带来的负面影响。植物细胞壁在植物抵御镉胁迫中起着固定和吸附的作用。木质素是细胞壁的组成成分之一,由木质素单体在咖啡酰辅酶A-O甲基转移酶(CCoAOMT)等酶的催化下聚合而成,木质素的合成能够参与植物对环境胁迫的响应。在本研究中,我们重点研究了CCoAOM对Cd胁迫的响应,并通过在拟南芥中过量表达箭舌豌豆CCoAOMT研究其在重金属耐性中的作用及其在Cd污染土壤修复中的潜力。从箭舌豌豆中克隆获得完整的咖啡酰辅酶A-O甲基转移酶(VsCCoA OMT)基因序列,并对其氨基酸序列和进化树进行了分析,结果表明VsCCoA OMT与水稻和玉米等单子叶植物CCoAOMT的同源性较高,且箭舌豌豆中CCoA OMT基因的氨基酸序列高度保守。半定量RT-PCR分析结果显示,VsCCoAOMT在箭舌豌豆的根、茎、叶中都有表达,在根部表达量较高。亚细胞定位的结果显示VsCCoAOMT的表达产物定位在整个细胞中(细胞壁除外)。Real-time RT-PCR结果显示,VsCCoAOMT对Cu、Cd、H202、NaCl、PEG均有响应。在Cd处理24 h后,VsCCoAOMT在耐Cd品种兰箭3号(L3)豌豆中表达量增加,而在Cd敏感品种张掖麻豌(ZM)中表达量下降;在Cu处理下,两个品种的箭舌豌豆的表达量都下降;而在H202、NaCl和PEG处理后,VsCCoAOMT的表达量都增加。当用25μM的Cd处理0、6、12、24 h后,在L3中VsCCoAOMT前6个小时的表达量增加,6个小时之后下降;而在ZM中表达量的变化不明显,在12 h之后表达量开始下调,这说明Cd耐性品种L3响应Cd胁迫的时间较早。由以上结果可以看出,VsCCoAOMT基因的表达受到Cu、Cd、H202、NaCl、PEG等非生物胁迫的诱导,属于非生物胁迫响应的基因。为了进一步研究VsCCoAOMT对Cd积累和分布的影响,我们构建了VsCCoAOMT的植物表达载体,并将其转入到模式植物拟南芥中进行超量表达。研究结果显示,在含70μM Cd的1/2 MS培养基上培养两周后,转VsCCoAOMT植株和野生型植株的生长都受到了抑制,但是转VsCCoAOMT植株的根长和干重都要显著高于野生型;在水培实验中,10 μM的Cd处理5天,转VsCCoAOMT基因拟南芥地上部和根部对Cd的积累都高于野生型,且转VsCCoAOMT拟南芥的Cd转运系数高于野生型;同样处理下,转VsCCoAOMT基因植株地上部和根部细胞壁中Cd的积累都高于野生型,而地上部和根部细胞质内的Cd积累都低于野生型;同时,在转基因植株地上部的纤维素,根部的果胶、半纤维素1和纤维素中Cd积累也较野生型高。对拟南芥茎和根部的组织化学染色结果显示,与野生型相比,转VsCCoAOMT拟南芥的染色较野生型深,即木质素积累较野生型多。进一步检测结果显示,在10 μM Cd处理5 d转VsCCoAOMT拟南芥的木质素含量高于野生型植株中的含量,这和番红固绿、间苯三酚染色的结果相一致。推测VsCCoAOMT增加木质素的沉积,减轻Cd对植物的毒害。在Cd污染土壤中,转VsCCoAOMT基因拟南芥的生长情况好于野生型,Cd积累也高于野生型。结果表明,转VsCCoAOMT基因可以增强拟南芥Cd耐性,能够增加Cd在地上部的积累;对Cd污染土壤也有一定的修复潜力。