研究背景与目的:肺神经内分泌肿瘤(Lung neuroendocrine tumor)来源于肺神经内分泌细胞,由大细胞神经内分泌癌、小细胞肺癌、肺神经内分泌类癌和不典型类癌组成。肺神经内分泌细胞的比例占肺内细胞比例的1/2500,因此,肺神经内分泌肿瘤的发生比例相对较低,总计约占全部肺癌的10%左右。其生物学行为与来自腺上皮的肺腺癌和来自于鳞状上皮化生的肺鳞癌有巨大的差异,它们极易在早期发生全身广泛转不移。即使被归入不同的肺癌类型,但其治疗均以包括依托泊苷在内的拓补异构酶抑制剂为重要化疗方案。虽然依托泊苷治疗效果较好,但其效果存在瓶颈,即早期发生耐药。本研究的目的,即寻找有效的抑制肺神经内分泌肿瘤耐药的靶点。通过建立耐依托泊苷的肺大细胞神经内分泌癌细胞株和耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株,通过对耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株的二代测序,并在肺大细胞神经内分泌癌细胞株中进行验证。寻找能够导致肺神经内分泌肿瘤耐药的关键分子,以及对于此分子进行调控的关键信号通路。从而为肺神经内分泌的治疗提供新的靶点。研究方法:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定(1)选择肺小细胞神经内分泌癌H446细胞株和肺大细胞神经内分泌癌H1155,通过药物梯度培养法逐步筛选和建立耐依托泊苷细胞系H446R和部分耐依托泊苷细胞株H1155r。(2)观察H446、H446R、H1155、H1155r细胞株的细胞形态和生长趋势,进行细胞增殖试验,分别绘制增殖曲线。(3)使用CCK-8试剂盒检测依托泊苷对H446、H446R、H1155和H1155r的抑制情况,并使用Graphpad prism 7.0绘制抑制曲线,计算其半数抑制浓度(IC50),鉴定其耐药情况。第二部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析(1)使用特别的细胞分组进行测序,将分组设定为H446、H446R、H446R+VP16三组,再分别进行测序。(2)分析样品碱基位置质量分数分布。(3)基因组分布情况评估。(4)分析其可变剪切分布情况。(5)对样本进行主成分分析及聚类分析,判断标本的同源性。(6)在三个差异基因集中取同向表达基因,排除无效基因的干扰。(7)通过限定基因变化幅度的条件。在有效基因中筛选可能的潜在靶点基因。(8)通过差异基因的PPI网络及HUB基因分析,进一步缩小差异基因的选择范围。(9)通过差异基因的GO及KEGG分析,分析差异表达的潜在靶点基因的可能生物学过程和信号通路。将基因缩小范围至30个左右。第三部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析(1)通过qRT-PCR在备选基因中验证其与二代测序的符合程度,进一步排除不符合基因。(2)使用 si-S100A9、si-ITGB3、si-COL6A2、si-CCL5、si-SH2D2A等干扰基因 ITGB3、SH2D2A、S100A9、CCL5、COL6A2 的 mRNA 表达,并使用CCK-8法对干扰后的细胞系进行细胞耐药曲线的绘制和IC50的计算。(3)使用Western blot对(2)中耐药影响明显的两个基因ITGB3和S100A9进行蛋白表达的验证。(4)在H446细胞株和H1155细胞株中使用慢病毒转染过表达S100A9,qRT-PCR验证S100A9的mRNA表达的变化,Western blot验证其蛋白表达的差异。使用CCK-8对过表达细胞株进行药敏试验,观察其对依托泊苷耐药程度的变化。(5)si-ITGB3干扰H446R和H1155r的ITGB3的表达,qRT-PCR验证ITGB3表达下降对S100A9的mRNA表达量的影响。Western blot验证S100A9蛋白表达的变化。(6)在H446R、H1155r中敲低ITGB3,Western blot验证其对ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路的影响最终导致了 S100A9的变化。研究结果:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定(1)从H446细胞株建立了稳定耐依托泊苷的耐药细胞株H446R,IC50约在325.4mg/L,RI>5。(2)从H1155细胞株建立了部分稳定的耐依托泊苷的耐药细胞株H1155r,IC50约在682.8mg/L,3