发现和确证新的药物作用靶点是药学研究的重要内容。核受体是一类配体依赖性激活的转录因子超家族，其在生长发育、新陈代谢、细胞分化和凋亡、免疫应答等人体许多重要生理过程中发挥关键作用。其中，异二聚体型核受体(heterodimernuclear receptors，HD-NRs)为核受体超家族中的主要成员。 维甲酸受体(Retinoid A receptor)、肝X受体(Live X receptor，LXRs)、法尼醇X受体(famesoid X receptor,FXR)均属于异二聚体型核受体亚家族，其参与调控体内的维甲类物质以及糖，脂质，胆固醇、胆酸代谢，在机体的代谢平衡中起关键的作用。它们与RXR形成二聚体后，通过与特异响应元件结合调节基因的转录。心脑血管疾病、2型糖尿病、肥胖、骨质疏松、皮肤病，炎症、神经退行性疾病和癌症等的发生均与其功能和调控异常有关。因此这类核受体可作为治疗代谢紊乱性疾病的新靶点。 本论文研究的主要内容为将异二聚体型核受体作为药物新靶点，进行适当的确证和评价，并利用新的药物筛选技术，建立高通量药物筛选平台，筛选发现新的先导化合物。本论文主要从以下几个方面开展研究： 一．维甲酸受体高内涵筛选体系的构建与应用作为经典的异二聚体型核受体，维甲酸受体经实验证实与癌症和皮肽病等多种疾病密切相关，其激动剂已成功用于这类疾病的防治。然而，传统的维甲酸受体激动剂，如全反式维甲酸仍具有一定的毒副作用。寻找高效、低毒、特异的小分子维甲类药物仍是目前研究的热点。本论文成功建立了一个稳定、灵敏、重复性好的维甲酸受体激动剂高内涵筛选体系，并结合虚拟筛选，从20,000个化合物中筛选得到了活性化合物7672和7666，并对7672进行了进一步的活性评价。 二．基于细胞的HD-NR激动剂高通量筛选和评价体系的建立和应用哺乳动物细胞单杂交技术是近些年发展起来，主要应用于核受体功能及其配体生理活性筛选和评价的新技术。该机理利用了核受体的分子结构中共有的两个主要结构域：配体结合结构域(LBD)和DNA结合结构域(DBD)，以及酵母细胞转录因子GAL4具有核受体相似结构的特点。将核受体的配体结合结构域(LBD)与酵母细胞转录因子GAL4的DNA结合结构域(DBD)融合成嵌合蛋白表达质粒，再与含有GAL4特异的响应元件的报告质粒共转染，通过测定报告基因的表达水平从而评价核受体配体的激动或拮抗活性。另外，因为哺乳动物细胞没有酵母的GAL4，所以不存在内源性核受体的之间的相互干扰和交叉效应，这也是该技术用于筛选和评价配体活性的最大优点。 为了研究和开发新的预防和治疗代谢紊乱性疾病的候选药物，以及进行相关机理研究，建立了基于哺乳动物细胞单杂新技术的异二聚体型核受体LXRα和FXR的高通量激动剂的筛选及活性评价体系。 首先利用RT-PCR技术从肝组织的总RNA中扩增LXRα和FXR的配体结合域(LBD)基因片断，并将其与酵母转录因子GAL4的DNA结合域连接构建融合表达载体pBIND-LXRR(α-LBD，pBlND-FXR-LBD：而采用的报告质粒pG5是由人工合成5xGAL4的相应元件，插入报告基因上游构建而成。 通过优化多种转染条件，确定了最佳的共转染条件。利用阳性药对细胞水平的FXR，LXR激动剂筛选模型进行了验证。阳性药在各自的模型中都呈现良好的量效关系和很高的信噪比，而且用于评价模型稳定性的参数z’因子均在0.5-0.7之间，从而证明了所建立的模型具有良好的灵敏度和稳定性。 经过筛选，从植物来源的纯化合物库中筛选得到了4个活性化合物，为特异的LXR激动剂，其对FXR有弱的激活作用。通过进一步的载体改构和细胞转染，基于哺乳动物单杂交技术原理，对新的HCS筛选体系的建立进行了初步摸索。 三．化合物对核受体调控作用对体外高通量筛选方法的建立和应用本研究成功建立了基于荧光偏振的评价配体结合LXR或FXR，募集共激活子能力的评价方法，其基本原理为当核受体与配体结合后，核受体构象会发生改变，从而促进了受体与共激活子的结合。利用核受体LBD及共激活子的LXXLL基序结合并采用荧光偏振的方法来筛选核受体的配体，该方法适用适用于所有代谢性异二聚体型核受体，包括RAR、CAR、VDR、PPAR、LXR和FXR等。 通过体外的FP体系评价，4个活性化合物不仅在细胞水平可激活LXR，还可以直接与LXR结合，并募集共激活子，为LXR的激动剂。 体外和细胞水平筛选平台的建立不仅可以在药物发现的早期确证核受体先导化合物，发现用于调控与代谢相关的基因而治疗代谢性疾病的药物，而且为受体生理机制的阐明提供了坚实的基础。 四、肝X受体活性化合物活性评价和抗动脉粥样硬化(AS)药理活性研究本论文首次发现了白藜芦醇四聚体的LXR激动活性，并首次揭示了其通过LXR通路在抗动脉粥样硬化中发挥作用的机制。 首先研究了化合物在HDL代谢和胆固醇逆向转运中的作用，发现化合物通过上调LXR的靶基因，可抑制泡沫化细胞的形成和促进脂装载的巨噬细胞中胆固醇的外排。 化合物还具有抗炎活性，其可降低炎性因子的表达并抑制单核细胞和内皮细胞的粘附。 化合物还可增加超氧化物歧化酶的活性，抑制丙二醛(MDA)产生，提示其可能还通过抗氧化作用在防治动脉粥样硬化中发挥作用。 总之，本论文通过对4个方面的具体研究内容，对药物发现过程中的靶点确证、模型建立和筛选、活性化合物的获得和评价等重要环节进行了研究，探讨了新药发现的特点和规律，为防治代谢紊乱性疾病的新药研究提供了实验基础。