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PPARγ是近二十年来发现的一种调节糖脂代谢,调控细胞增殖、分化、凋亡,参与炎症、肿瘤、糖尿病、高血压、肥胖症等疾病过程的核受体转录因子。静息状态下,目的基因启动子区域异二聚体(PPARγ与视黄酸X受体)和核共抑制物结合,抑制目的基因转录;在配体作用下,其构象改变,一方面与核共抑制物解离,另一方面与目的基因启动子区域的DNA序列特异性结合,从而启动目的基因转录。PPARγ通过调节其下游目的基因的转录过程,进而间接调控疾病的发生发展。牙周炎是以龈下菌斑(包括革兰阴性菌及其释放的内毒素)为始动因素,牙齿周围局部环境和全身因素等为促进因素引起的牙齿周围组织包括牙龈、牙骨质、牙周膜、牙槽骨的破坏为特征的慢性进行性炎症。牙周炎的临床表现主要是软组织如牙龈的炎症和骨组织如牙槽骨的吸收破坏,而PPARγ参与炎症和骨代谢的调节,因此有必要探究PPARγ在牙周炎中发挥的作用。牙周膜连接牙体和牙周组织,炎症刺激引起的牙周附着丧失是牙周炎的病理基础。PPARγ主要在脂肪组织中表达,少量表达于免疫细胞、内皮细胞等组织细胞中。本研究采用LPS作用于牙周膜细胞模拟牙周炎,研究PPARγ对牙周膜细胞炎症反应的作用及其机制。在牙周膜细胞群中,牙周膜干细胞具有多向分化潜能,既能形成软组织细胞如成纤维细胞还能形成硬组织细胞如成骨细胞、成牙骨质细胞等。本研究对牙周膜细胞群进行矿化诱导,探讨PPARγ在炎症和非炎症状态下对牙周膜细胞的矿化影响及其机制。目的1.培养原代牙周膜细胞,检测不同组细胞NF-κB信号通路的变化和其下游炎症因子IL-1β和TNF-α的表达改变,探究PPARγ在牙周炎中对人牙周膜细胞炎症反应的影响及其作用机制。2.对牙周膜细胞群进行矿化诱导,观察不同组细胞成骨相关基因、矿化程度以及β-catenin信号通路改变,探讨PPARγ在炎症和非炎症状态下对人牙周膜细胞成骨影响和机制。材料和方法1.组织块法培养健康hPDLCs并鉴定。细胞分为对照组、LPS刺激组、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)组和RGZ组四组进行处理。免疫印迹法检测PPARy和NF-κB p65蛋白表达,细胞免疫荧光检测NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表达及细胞部位。qPCR和ELISA检测IL-1β和TNF-α的RNA和蛋白表达。2.hPDLCs细胞培养同上所述,在炎症和非炎症状态下,采用PPARy激动剂(罗格列酮)和抑制剂(GW9662)刺激细胞,分为对照组、RGZ组、RGZ+GW9662组、LPS刺激组、LPS+RGZ组、LPS+RGZ+GW9662组六组并进行矿化诱导处理3、7、14、21天。ALP活性和染色试剂盒检测ALP含量变化;实时荧光定量PCR 检测矿化相关基因 RUNX2、OCN、OPG、RANKL、ColI、BMP2、ALP 表达;茜素红染色观察不同组矿化结节生成差异;免疫印迹法检测不同组细胞β-catenin在总蛋白及胞核胞浆蛋白中的变化。结果1.hPDLCs在LPS刺激下,胞核PPARly蛋白表达降低,NF-κB p65蛋白表达升高,相应的IL-1β和TNF-αRNA及蛋白的表达均升高。同时加入RGZ后,胞核PPARy表达升高,NF-κB p65表达降低,IL-1(3、TNF-α RNA以及蛋白的表达均降低。以上差异均有统计学意义(P<0.01)。2.在炎症和非炎症状态下,矿化诱导3、7、14天时PPARy激动剂可提高人牙周膜细胞ALP的RNA表达和蛋白活性(P<0.05)、促进矿化结节的生成、减少总蛋白和胞核蛋白中β-catenin的含量(P<0.05),PPARy抑制剂可降低PPARy激动剂作用下人牙周膜细胞ALP的RNA表达和蛋白活性升高(P<0.05)、抑制矿化结节生成增多,但无法逆转β-catenin的含量变化;矿化诱导21天时PPARγ激动剂抑制矿化结节的生成。较非炎症状态,炎症状态时,PPARly激动剂促进OPG、BMP2 基因表达(P<0.05)。结论1.在牙周膜细胞中,PPARy能够阻断NF-κB信号通路,抑制LPS刺激下炎症因子IL-1β、TNF-ta的RNA表达和蛋白分泌,进一步调控牙周炎症反应。2.在炎症和非炎症状态下,PPARty可促进人牙周膜细胞的成骨,但不依赖于β-catenin信号通路,具体机制尚需进一步研究。对PPARγ的深入研究能为临床牙周炎治疗提供新的治疗思路。