肿瘤细胞及端粒酶检测的生物传感技术新方法的研究

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各种疾病已经严重威胁到了人类的健康,而随着人类生存环境的恶化,肿瘤更是目前夺取人们性命的一大杀手。肿瘤的发生严重影响着人们的生活质量,危及着人们的生命安全,实现肿瘤细胞的准确、快速、简便检测,对于疾病的确诊与治疗具有非常重要的意义。端粒酶则是各种恶性肿瘤细胞一个共同的分子标志物,对端粒酶活性的检测于癌症的早期发现、发展和预后都有重大意义。本论文结合了近年来出现的一些新的传感识别元件,利用电化学、光化学检测方法研究了对肿瘤细胞及端粒酶活性的检测。1.本章我们利用细胞核酸适体以及生物催化银沉积信号放大方法建立了一种检测肿瘤细胞-人B淋巴细胞瘤(Ramos细胞)的电化生物传感器。首先我们利用巯基修饰的细胞核酸适体在金电极上捕获细胞,通过Ramos细胞与另一条生物素标记的核酸适体的特异性结合作用,形成了核酸适体-细胞-核酸适体的夹心复合物。然后通过核酸适体上标记的生物素与链酶亲和素标记的碱性磷酸酶(ALP)作用,ALP催化抗坏血酸磷酸脂形成的抗坏血酸还原Ag+成金属单质Ag沉积在电极表面,采用线性扫描伏安法(LSV)检测Ag的电化学信号,实现对Ramos细胞的放大检测。结果表明,检测Ramos细胞的线性关系范围是10-106cells,检测到的细胞最小浓度为10cells,说明其具有很好的检测灵度。该方法低的检测限归结于生物催化银沉积的放大作用。2.本章是基于端粒酶扩增反应以及目标物诱导DNA链结构变换的方法建立的一种用于检测端粒酶活性的电化学生物传感器。巯基修饰的端粒酶(TS)引物链组装在金电极上,二茂铁标记的短链DNA与之杂交,由于二茂铁接近电极表面而发生高效的电子传递。在端粒酶和混合核苷酸(dNTPs)的存在下,TS引物链开始扩增重复序列TTAGGG,而扩增的重复序列与杂交区域的碱基互补,可以杂交形成双链,致使折叠成“发卡”结构,二茂铁标记的DNA短链则从电极表面释放下来,氧化还原峰电流信号减小。通过氧化还原峰电流信号实现对端粒酶活性的检测。此方法的检测范围是100-60000cells,检测到的细胞最小浓度为100cells。该方法对端粒酶活性的检测具有灵敏度高、操作简单和背景信号低,不易出现假阴性结果等优点。3.本章是基于端粒酶扩增反应,目标物诱导DNA链结构转换以及纳米金信号放大的方法建立了一种荧光生物传感器用于端粒酶活性的检测。巯基探针和荧光探针先退火杂交,然后将杂交双链通标记在纳米金颗粒上,这样拉近了纳米金与荧光基团FAM之间的距离,由于纳米金的猝灭作用,致使FAM的荧光强度大大降低。在端粒酶和混合核苷酸(dNTPs)的存在下,TS引物链开始扩增重复序列TTAGGG,而扩增的重复序列与杂交区域的碱基互补,可以杂交形成双链,致使折叠成“发卡”结构,FAM标记的DNA短链则从纳米金表面释放下来,游离的荧光基团由于远离纳米金表面而显示出很大的荧光强度,即可实现对端粒酶活性的检测。研究结果表明该方法可以更灵敏、有效、方便地检测端粒酶的活性。其检测范围是100~20000cells,检测到的细胞最小浓度为100cells。
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