DNA条形码COI序列在肉类鉴别中的应用研究

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市场中销售的动物源性食品,通过掺杂、掺假等手段欺骗消费者而牟取暴利的事件屡屡出现。为了对市场上的动物源性食品进行掺假鉴定,判别与产品标签是否相符,本研究通过DNA条形码技术鉴别肉类及其制品,建立基于DAN条形码技术的鉴别方法。  1.通过提取牛、羊、猪、鸡、鸭、兔、鼠、狗、狐、貉、马、驴12个物种的基因组DNA为模板,利用14对引物进行PCR扩增和测序比对(其中8对引物根据12个物种基因的保守序列设计,6对引物来源于参考文献和数据库),建立12种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。筛选出通用引物COI-4和COI-14为较优序列,其中引物COI-4在除兔肉和驴肉外的10个物种中扩增效率100%,引物COI-14在除狗肉外的11个物种中扩增效率100%,两对引物组合可对12种肉进行检测。  2.通过定量提取生鲜牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉基因组DNA,按一定比例进行预混合,构建牛肉掺猪肉、羊肉掺猪肉、牛肉掺鸭肉和羊肉掺鸭肉4种掺假模型。通过引物COI-4和COI-14进行PCR扩增和测序比对,建立基于COI基因的动物源性食品的掺假判别方法。根据实验所得纯肉DNA提取率T实现DNA水平到肉水平掺假比例的换算。通过引物COI-4,在DNA水平上对牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型的检出限分别可以达到40%、10%、50%和50%,在肉水平上对牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型的检出限分别可以达到40%、15%、19%和28%;通过引物COI-14,在DNA水平上对牛-猪、羊-猪和牛-鸭模型的检出限可以达到5%,羊-鸭的模型的检出限可以达到10%,在肉水平上牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型的检出限分别可以达到5%、8%、1%和4%。  3.通过建立的DNA条形码技术鉴别方法对市售的动物源性食品主要为掺假严重的牛羊肉食品进行鉴定,判断与所贴标签是否相符。本研究成功对83批次的动物源制品完成检测及判定,89%的样品与产品标签标识的成分相符。其中牛肉制品,84%的样品与产品标签标识的成分相符;羊肉制品,84%的样品与产品标签标识的成分相符;驴肉制品,83%的样品与产品标签标识的成分相符,其他的肉制品未出现掺假和标签不符现象。  4.为实现快速检测,本研究通过引物COI-14进行扩增,采用AluI和HinfI两种限制性内切酶进行酶切,建立PCR-RFLP鉴别技术。四种肉的PCR产物通过内切酶AluI,牛肉的PCR产物被酶切成188bp和533bp两个片段;羊肉的PCR产物被酶切成26bp、227bp和468bp三个片段;猪肉的PCR产物被酶切成129bp、348bp和373bp三个片段;鸭肉的PCR产物被酶切成306bp和415bp两个片段,四种肉可以通过酶切清晰的分辨出来。四种肉的PCR产物通过内切酶HinfI,牛肉的PCR产物被酶切成259bp和462bp两个片段;羊肉的PCR产物被酶切成56bp、181bp和514bp三个片段;猪肉的PCR产物被酶切成193bp、240bp和288bp三个片段;鸭肉的PCR产物被酶切成356bp和363bp三个片段,四种肉可以通过酶切清晰的分辨出来。所以可用建立的PCR-RFLP鉴别技术对四种常见肉类进行鉴定。
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