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禽流感（Avian influenza,AI）是由A型流感病毒（AIV）引起的一种禽类疾病综合症,被国际兽医局确定为Ⅰ类烈性传染病。自1878年首次发现至今,世界各地都有特定的毒株引起禽流感的爆发和流行,给养禽业造成了极大的经济损失。2004年亚太地区爆发禽流感,并有传染给人甚至致人死亡的诸多报道,因而引起了我国政府及普通民众的广泛关注。鉴于我国地域广阔,禽类总数占有量大,禽产品流通频繁,一旦发生禽流感后难以从外界环境中彻底清除,而且禽流感病毒存在抗原漂移和抗原转变,低致病力的毒株也有可能突变为高致病力的毒株,这给我国养禽业造成了极大的潜在性威胁。因此,若能适时进行快速诊断,查明病原,在流行初期即能检测出鸡体是否感染了AIV,从而为快速处置预案或早期预防治疗提供诊断依据,最大限度地减少经济损失,就显得尤为重要。为此,本研究拟通过研制出AIV H5、H9亚型血凝素特异性的单克隆抗体,建立一种能快速区分高致病性禽流感H5亚型和低致病性禽流感H9亚型的夹心ELISA鉴别诊断试剂盒,主要研究工作和结果如下。 1.禽流感病毒H5、H9亚型血凝素单克隆抗体的研制 将AIV H5和AIV H9分别经9～11日龄鸡胚传代后,收获鸡胚尿囊液,经27000r/min超速离心1h,沉淀用0.01mol/L,pH7.2的PBS重悬,测得尿囊液和浓缩液的血凝效价分别为26和211,将浓缩悬液分别与等量佐剂混合后免疫Balb/c鼠,按常规方法取免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用AIV H9、H5血凝素抗原以血凝抑制试验进行筛选和克隆,获得了七株杂交瘤细胞。其中,抗AIV H5的杂交瘤细胞株为H5284、H53C9、H55E8、,经亲和力测定单抗H5284与AIV H5亲和力最好;抗AIV H9的杂交瘤细胞株为H91G3、H92C2、H94C4、H91C6;单抗H94C4与AIVH9亲和力最好。两株单抗腹水效价分别可达213-20;所有杂交瘤细胞染色体数目均在82～92条之间,高于脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞染色体数目;各株单克隆抗体杂交瘤细胞经冻存与复苏,仍能稳定分泌抗体。所获得七种单克隆抗体腹水对相应AIV病毒液血凝抑制价效价均在213-220;两种单抗互相之间以及与其他无关的禽类病毒之间无任何交叉反应;为禽流感的夹心ELISA鉴别诊断方法的建立奠定了基础。 2.禽流感病毒H5、H9亚型ELISA鉴别诊断方法的建立 用抗AIV H5亚型血凝素单克隆抗体为包被抗体,兔抗AIV IgG为第二抗体;同时用鸡抗AIV IgG为包被抗体,抗AIV H9亚型血凝素单克隆抗体为第二抗体,通过ELISA反应条件的优化,分别建立了检测禽流感病毒H5、H9亚型抗原的夹心