近年来,人们发现在卵巢肿瘤组织中丙酮酸脱氢酶激酶I(PDK1)过表达,同时有研究表明PDK1是潜在的抗肿瘤靶点。前期计算机分析工作显示香豆素类化合物可能是有效的PDK1抑制剂。双香豆素是香豆素类化合物的一种,在临床被应用为抗凝药60余年,近期被发现可以抑制肿瘤生长,然而机制不清。本文通过计算机分析发现其可以结合PDK1的硫辛酰胺的位点。因此我们推测双香豆素可以通过抑制PDK1来促进卵巢癌肿瘤细胞凋亡,是具有抗肿瘤作用的新型生物靶向药,在未来可以广泛用于临床。目的:本文通过给予卵巢癌细胞及动物模型双香豆素,观察细胞内糖代谢改变、活性氧簇的水平、线粒体膜电势的高低、凋亡率以及动物模型肿瘤体积和重量的改变,研究其在促进卵巢癌细胞凋亡的潜在用途及其抗肿瘤的可能机制。方法:1.通过计算机分析以及酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测PDK1活性实验研究双香豆素能否结合PDK1并抑制其活性。通过免疫印迹法检测卵巢癌细胞在双香豆素作用下PDK1的表达。应用MTT比色法,Hoechst 33342免疫荧光染色,Annexin V/PI流式细胞术以及免疫印迹法检测Caspase3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达以评估双香豆素对卵巢癌细胞凋亡的影响。2.应用葡萄糖定量试剂盒和乳酸定量试剂盒测定双香豆素处理卵巢癌细胞后耗糖量和乳酸生成量的改变,同时应用时间分辨荧光探针检测卵巢癌细胞耗氧量和泌酸量的实时改变,评估双香豆素对卵巢癌细胞的糖代谢改变。测定线粒体内活性氧簇(ROS)以及线粒体膜电势(MMP)的水平以评价双香豆素对卵巢癌细胞的氧化还原水平以及线粒体功能的影响。3.构建SKOV3皮下成瘤裸鼠模型,分析腹腔注射双香豆素对该种动物模型肿瘤生长的影响。成瘤裸鼠随机分为5组,生理盐水组、溶剂对照组、阳性对照组,低剂量双香豆素组和高剂量双香豆素组。通过对成瘤裸鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量的组间比较以及TUNEL、p-PDHA1免疫组化(IHC)实验,评估双香豆素腹腔注射在卵巢癌皮下成瘤的裸鼠中的安全性、有效性。结果:1.经计算机软件分析,双香豆素可以与丙酮酸脱氢酶激酶I的硫辛酰胺位点结合。通过ELISA试剂盒检测,发现双香豆素可以抑制PDK1活性,半数抑制率IC50(19.42±0.032μM)。免疫印迹法发现,双香豆素可以上调卵巢癌细胞中Caspase3与PARP的表达。MTT比色法,Hoechst染色,Annexin V/PI流式细胞术以及免疫检测显示双香豆素可以促进卵巢癌细胞凋亡。2.双香豆素作用于卵巢癌细胞24h后测定胞外葡萄糖含量以及乳酸含量,发现耗糖量升高而乳酸生成量降低。时间分辨荧光实时检测显示卵巢癌细胞在双香豆素作用下耗氧率升高和胞外泌酸率降低,逆转了卵巢癌细胞的瓦伯格(Warburg)效应,即从有氧糖酵解转化到氧化磷酸化。流式细胞术检测显示卵巢癌细胞在双香豆素的作用下线粒体内ROS水平升高而MMP降低。3.双香豆素腹腔注射入卵巢癌皮下成瘤裸鼠后,裸鼠体重改变不明显,肿瘤体积较生理盐水对照组小,肿瘤重量轻。p-PDHA1免疫组化染色发现双香豆素可以下调p-PDHA1表达,间接反映其可使PDK1活性降低,TUNEL染色显示双香豆素可以促进卵巢癌细胞凋亡。结论:在本文中,我们运用计算机分析技术首次发现双香豆素是一种潜在的新的丙酮酸脱氢酶激酶抑制剂,同时我们应用ELISA技术确定了双香豆素能与PDK1结合并抑制PDK1的活性。免疫印迹法及免疫组化验证了双香豆素不仅在细胞水平而且在组织水平均能下调p-PDHA1的表达,间接反映了双香豆素可以抑制PDK1的活性。耗糖量升高,乳酸含量降低、线粒体内ROS水平升高以及MMP水平的下降均显示双香豆素可以重构卵巢癌肿瘤细胞的糖代谢方式,促进有氧糖酵解向氧化磷酸化转化。MTT比色法、Hoechst染色、Annexin V/PI、TUNEL染色、Caspase3以及PARP的免疫印迹的检测说明双香豆素在不同水平均可促进卵巢癌细胞的凋亡。综上,双香豆素通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶I的活性进而促进卵巢癌肿瘤细胞凋亡。这不仅为PDK1抑制剂家族添加了一位新成员,补充了双香豆素抗肿瘤的机制,还同时有力证明了PDK1是逆转肿瘤细胞糖代谢方式进而促进肿瘤细胞凋亡的关键分子。