磷(Pi)在植物新陈代谢过程发挥重要作用,磷转运蛋白是植物转运、吸收磷的必需蛋白。紫萍在各地水域中十分常见,生命力极其旺盛,可以吸收水中的钙、氮、磷等元素,也能吸收铜、铁、镉等重金属元素。因此,克隆、开发并合理利用紫萍的磷转运蛋白基因,为研究紫萍净化水体的机理、解析紫萍高效吸收磷的分子机制并为用于促进作物高效吸收磷提供理论依据,为开发优质经济作物提供基因资源。本文以紫萍为材料,克隆得到磷转运蛋白基因并预测理化性质,研究基因在不同外界环境的表达模式。分析获得该基因上游启动子序列并预测存在的顺式作用元件,克隆4个5′端启动子缺失片段并导入转基因烟草中稳定表达。主要结论有:1.克隆紫萍磷转运蛋白基因并命名Sp PHT1。利用生物信息软件分析表明,Sp PHT1基因序列有1620 bp,无内含子区域,编码539个氨基酸。Sp PHT1蛋白分子量59.19k D,等电点8.51,有11个跨膜区,是一种稳定的疏水性蛋白,包含与MFS超家族、糖转运蛋白家族相似的结构域,而且Sp PHT1蛋白氨基酸序列与玉米、高粱、油茶、茶树等15种植物PHT1氨基酸序列有80%以上的相似性,表明Sp PHT1编码的蛋白属于PHT1家族成员。2.通过荧光定量PCR来研究Sp PHT1基因在不同环境的表达模式。基因在低磷、原磷、丰磷的三种条件下表明:低磷条件促进基因表达,相对表达量在紫萍根和叶生长48h时均达到峰值;丰磷条件会抑制基因表达;三种不同磷浓度条件下,基因都在紫萍叶表达明显多于根。基因在24h昼夜节律表达表明:基因在紫萍根和叶中的表达趋势均呈现先增后减再增加,表达量在黑暗条件达到峰值,基因在紫萍叶表达量仍多于根。表明Sp PHT1基因在紫萍叶中表达多余根中且受外界磷素及光的负调控影响。3.克隆紫萍Sp PHT1基因上游5′启动子序列(1435bp)命名为Sp PHT1p。利用生物信息学软件分析其包含顺式作用元件为:核心元件(CAAT-box、TATA-box)、光响应元件(Box 4、G-Box、G-box、TCCC-motif)、激素响应元件(ABRE、TGACG-motif、ERE)、逆境调控元件(ARE)、分生组织特异性元件(CCGTCC-box)、其他功能元件(AAGAA-motif、Unnamed 1)。构建4种5′缺失片段启动子的表达载体,成功转入烟草进行稳定表达得到4种对应转基因烟草ZF1、ZF2、ZF3、ZF4。将对照组和转基因烟草的根茎叶分别进行GUS染色和GUS酶活检测,结果一致表明:该基因启动子活性随着启动子片段增长而增加,但含最长的启动子片段的植株根、茎、叶均无GUS活性,推测Sp PHT1p序列中存在负调控下游基因表达的功能元件;启动子只在植株根、茎中有GUS的活性表达,且在植株的根中表达量明显多余茎,推测Sp PHT1p序列中存在根、茎组织特异性表达元件的功能元件。