【摘 要】
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目的:在已成功制备梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架的基础上,通过复合BMP2-ADSCs和自体PRP凝胶构建骨软骨移植体修复比格犬膝关节骨软骨缺损,完成移植体总体性能的检测,以期为修复骨软骨缺损提供一种更加合适的骨软骨移植体。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化的方法提取比格犬ADSCs,培养至第3代,通过CCK-8法检测ADSCs增殖活性,通过免疫荧光和流式细胞术鉴定ADSCs表面抗原的表型。探索LV
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目的:在已成功制备梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架的基础上,通过复合BMP2-ADSCs和自体PRP凝胶构建骨软骨移植体修复比格犬膝关节骨软骨缺损,完成移植体总体性能的检测,以期为修复骨软骨缺损提供一种更加合适的骨软骨移植体。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化的方法提取比格犬ADSCs,培养至第3代,通过CCK-8法检测ADSCs增殖活性,通过免疫荧光和流式细胞术鉴定ADSCs表面抗原的表型。探索LV-BMP2-GDF转染ADSCs的最佳MOI值,对BMP2-ADSCs进行传代培养后通过RT-PCR检测种子细胞中BMP-2基因水平。对比格犬静脉血通过离心的方法制备PRP,利用牛凝血酶激活PRP为凝胶状态,利用ELISA检测PRP凝胶中TGF-β1和PDGF-BB释放水平。利用梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架、BMP2-ADSCs、自体PRP凝胶构建骨软骨移植体,将移植体植入比格犬膝关节股骨远端滑车中央骨软骨缺损处。将24只比格犬随机分为A组(细胞-PRP-支架组)、B组(PRP-支架组)、C组(单纯支架组)和D组(空白对照组),A组:BMP2-ADSCs+PRP凝胶+支架;B组:PRP凝胶+支架;C组:支架;D组:空白对照组。细胞-PRP-支架组分别在术前、术后、术后1月和术后2月进行X射线诊断,分析骨软骨缺损中骨质的再生效果。术后2月取细胞-PRP-支架组骨软骨缺损修复处组织进行涂片,倒置荧光显微镜下观察样本涂片是否有免疫荧光。取各组术后4月骨软骨缺损修复样本做免疫组织化学检测ColⅠ、ColⅡ,做H&E染色、甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色观察骨软骨再生修复情况。结果:采用Ⅰ型胶原酶消化法提取的比格犬ADSCs呈漩涡状样生长,细胞形态均一,梭形和纺锤形明显,具有良好的增殖活性。通过免疫荧光和流式细胞术鉴定ADSCs表型结果一致CD90(+)、CD44(+)、CD29(+)、CD34(-)、HLA-DR(-)、Blank(-)、Isotype control(-)。LV-BMP2-GFP转染ADSCs最佳MOI值为60。RT-PCR检测BMP-2基因水平结果显示LV-BMP2-60组中BMP-2基因水平显著高于LV-BMP2-NC组和Mock组。PRP激活后提取液ELISA结果显示TGF-β1释放量:214.39±35.41ng/m L;PDGF-BB释放量:33.159±2.16ng/m L。截取各组术后2月和4月骨软骨缺损修复处样本大体观察,术后2月和4月细胞-PRP-支架组缺损修复情况均显著好于PRP-支架组、单纯支架组和空白对照组。细胞-PRP-支架组在术前、术后、术后1月、术后2月X射线拍照的结果显示,骨软骨缺损处骨质再生呈良好的渐进修复趋势。术后2月取细胞-PRP-支架组骨软骨缺损修复处组织涂片结果显示,大量存在绿色荧光组织。各组术后4月骨软骨缺损修复样本免疫组织化学检测ColⅠ、ColⅡ结果显示,细胞-PRP-支架组ColⅠ、ColⅡ表达量显著高于PRP-支架组、单纯支架组和空白对照组,空白对照组ColⅡ几乎无表达。各组术后你4月骨软骨缺损修复样本H&E染色、甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色结果显示,细胞-PRP-支架组修复的软骨层与周围正常软骨形态和厚度相似,PRP-支架组和单纯支架组修复的软骨形态和厚度均差于细胞-PRP-支架组,空白对照组无软骨层。结论:本研究通过提取纯度较高的ADSCs、LV-BMP2-GFP转染ADSCs、制备PRP凝胶、梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架成功构建了骨软骨移植体。通过各种骨软骨相关检测方法证实了移植体对OCD具有良好的再生修复效果。本研究所构建的骨软骨移植体有望成为修复OCD的仿生复合材料。
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