中慢生型天山根瘤菌luxI类AHL合成酶基因的鉴定、表达及对共生结瘤的影响

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jiangjia09
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根瘤菌可以在豆科植物根部形成根瘤从而固氮空气中的N2,这其中包括了一系列不同的信号传导过程。在许多根瘤菌中发现LuxR-LuxI类群体感应是其中重要的调节因素之一,如调控结瘤效率,共生体的形成,胞外多糖的产生和固氮效率等。但目前对生长速度介于快生和慢生之间的中慢生型属根瘤菌的群体感应系统还没有确切的报道。 本文将中慢生型属八个种的模式菌株培养至高细胞密度,对培养上清进行了乙酸乙酯的萃取抽提,应用高效检测菌株JZA1对其中的AHL分子进行了TLC分析。结果发现,中慢生型属八种模式菌产生AHL信号分子的能力和类别有很大的差异性。其中可以在甘草等至少八种不同的豆科植物根部结瘤的中慢生型天山根瘤菌CCBAU 3306产生的AHL信号分子种类最多(八种)。对中慢生型天山根瘤菌进一步的研究发现,其培养上清中AHL的产生活性具有典型的依赖细胞密度的特征,即在低细胞浓度时产生较低的AHL活性,高细胞浓度时则产生较高的AHL活性。其后AHL活性降低则是由于在菌体生长后期pH值升高而导致了AHL分子的碱水解作用。 为了鉴定M.tianshanense中负责产生AHL分子的基因,在高拷贝质粒pEZSeq-Kan中构建了M.tianshanense的基因文库并电转化至E.coli中进行表达。采用了一种简单新颖的筛选方法快速的从基因文库细胞中筛选获得了3株可以产生较高AHL活性的阳性克隆。对这3株阳性克隆质粒进行酶切分析确定pHMZ9B1中含有的插入片断最大,其测序结果表明,pHMZ9B1中的外源插入片断中含有4061bp碱基,该插入片断中含有一个665bp的ORF和一个在其上游大小为819bp的ORF,经balst分析,确定与其它几种LuxI和LuxR型的转录调控蛋白具有不同的同源性,因此分别被定名为MrtI和MrtR。 为了验证在E.coli库细胞中筛选鉴定得到的LuxI同源物MrtI在M.tianshanense中是否确实产生AHL信号分子,将mrtI侧翼区进行overlapping PCR并克隆至sacB自杀性质粒载体pWM91中,与野生型菌株接合后进行同源基因的双交换筛选获得了mrtI完全突变缺失株。对mrtI突变株的培养上清进行液体活性和TLC分析均未检测到AHL活性。而MrtI/MrtR区域在E.coli中可以表达至少6种不同的AHL分子。同时对新的M.tian-shanense基因文库进行了重复的筛选均未发现不同于mrtI的自体诱导物合成酶基因,因此在M.tianshanense中MrtI负责了合成所有的AHLs分子。 为了研究M.tianshanense中AHL合成酶基因mrtI的表达情况,PCR扩增mrtI基因的
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