【摘 要】
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玉米（Zea mays L.）是世界上主要粮食作物之一,也是畜牧业、养殖业的重要饲料来源,广泛用于食品加工、医疗卫生、轻工业以及化工业等。籽粒是玉米的主要利用产物,而淀粉含量占籽粒干重的70%左右,是玉米籽粒的重要组成成分。淀粉主要在胚乳中合成,其合成过程主要包括ADPG的合成与转运、葡聚糖链的延伸、葡聚糖链的分支及去分支以及淀粉颗粒形成等步骤。淀粉生物合成过程主要由四种关键酶共同参与,即腺苷二磷
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玉米（Zea mays L.）是世界上主要粮食作物之一,也是畜牧业、养殖业的重要饲料来源,广泛用于食品加工、医疗卫生、轻工业以及化工业等。籽粒是玉米的主要利用产物,而淀粉含量占籽粒干重的70%左右,是玉米籽粒的重要组成成分。淀粉主要在胚乳中合成,其合成过程主要包括ADPG的合成与转运、葡聚糖链的延伸、葡聚糖链的分支及去分支以及淀粉颗粒形成等步骤。淀粉生物合成过程主要由四种关键酶共同参与,即腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase,AGPase）、淀粉合酶（Starch synthase,SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme,SBE）及淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme,DBE）,有研究认为淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase,SP）在淀粉合成过程中也起着重要作用。淀粉生物合成调控机制复杂,转录水平的调控主要依赖于淀粉合成相关酶编码基因启动子上的顺式作用元件和参与基因转录调控的反式作用因子,从而对功能酶编码基因在转录水平实现精细调控,影响淀粉的生物合成。鉴定参与玉米籽粒淀粉合成调控的反式作用因子,将有利于完善玉米籽粒淀粉生物合成的分子调控网络。课题组前期通过共相关分析获得与淀粉生物合成相关的ZmbZIP46候选转录因子,本试验以玉米自交系W22为试验材料,对zmbzip46突变体进行多代回交、自交获得遗传稳定的Mu插入纯合突变体,分析ZmbZIP46基因时空表达特性;分析ZmbZIP46自激活活性与亚细胞定位;利用本课题组建立的胚乳瞬时表达体系分析转录因子ZmbZIP46对淀粉合成关键酶基因表达的影响;酵母单杂交试验与体外Ch IP试验分析转录因子ZmbZIP46与下游淀粉合成关键酶基因启动子的结合作用;实时荧光定量PCR分析纯合突变体淀粉合成关键酶酶基因的表达变化;分析野生型与纯合突变体中AGPase、SSs、GBSS酶活性差异以及淀粉积累差异。结合课题组前期研究基础,研究ZmbZIP46参与淀粉生物合成的转录调控机制,主要结果如下:1.对ZmbZIP46基因进行序列分析和克隆发现ZmbZIP46是b ZIP家族转录因子,编码480个氨基酸,含保守结构域BRLZ,存在同源基因（Zmb ZIP22）。2.对玉米自交系W22中ZmbZIP46基因表达分析结果表明,ZmbZIP46基因在授粉后10-15天的籽粒胚乳中高表达;亚细胞定位分析发现其定位于细胞核,酵母自激活分析发现其有转录激活活性。3.通过基因枪瞬时转化分析转录因子ZmbZIP46参与淀粉合成关键酶相关基因转录调控机制,测定LUC/GUS活性分析可得ZmbZIP46能极显著促进启动子p Bt2、p SBE2b、p SS2、p SBE1、p SS3a的活性,显著影响启动子p ISA1、p Sh2的活性,而对启动子p GBSS1、p Phol、p SS2a、p Bt1的活性影响并不明显,结果表明,ZmbZIP46对部分淀粉合成关键酶基因启动子具有调控作用。实验通过酵母单杂交试验以及ZmbZIP46蛋白体外Ch IP-Seq试验测序分析以及Ch IP-PCR验证富集目的蛋白结合的DNA片段结果表明,ZmbZIP46转录因子能与淀粉合成关键酶基因ISA1启动子发生直接结合作用。4.对突变体进行多代回交和自交,已获得稳定的zmbzip46纯合突变体。通过实时荧光定量PCR对zmbzip46纯合突变体中13个淀粉合成关键酶基因表达水平进行检测,结果表明,ZmbZIP46基因突变对玉米籽粒中淀粉合成关键酶基因Zm Bt2、Zm ISA1、Zm SBE2b、Zm SS3a、Zm SBE1的表达有显著影响,对Zm Bt1、Zm Sh1、Zm Sh2、Zm SS1、Zm SS2a、Zm GBSS1、Zm Phol等基因的表达无明显影响。5.对玉米自交系W22和zmbzip46纯合突变体AGPase、SSs、GBSS酶活性测定结果发现,自交系W22和zmbzip46纯合突变体15 DAP胚乳籽粒中酶活差异小,20 DAP突变体较野生型AGPase、SSs、GBSS活性显著降低。对成熟籽粒进行总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量测定,zmbzip46突变体淀粉含量与野生型相比,总淀粉含量降低2%左右,直链淀粉含量和支链淀粉无明显变化。6.在前期实验基础上,通过对ZmbZIP46基因生物信息学分析发现玉米中存在与其同源关系极近的基因Zmb ZIP22,蛋白序列相似度接近80%,单基因突变对淀粉合成影响较小,因此通过构建双敲除转基因载体,期得到双突变体材料,进一步探究ZmbZIP46转录因子参与玉米淀粉合成的调控机制。
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