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研究目的随着基因编辑技术的逐步发展,过继性免疫治疗(Adoptive cellular therapy,ACT)在肿瘤生物治疗中占据着越来越重要的作用。由于诸多限制,以往的过继免疫治疗并未产生持续、明显的抗瘤作用。但是一种新的过继性免疫疗法--嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的发展极大的增强了过继性免疫治疗的治疗效果,其突出优点是可以克服MHC限制性。CD19抗原特异性表达于B淋巴细胞及B系血液肿瘤细胞表面,在正常的造血干细胞表面不表达,是CAR-T治疗B系血液肿瘤的研究热点。本课题以pc DNA?3.1(+)为质粒载体,使用小鼠抗人CD19单抗(克隆号:FMC63)为胞外单克隆抗体单链可变区序列,以CD137为共刺激分子,T细胞受体(TCR)/CD3的-δ链作为胞内信号结构域来构建第二代嵌合抗原受体。同时采用不同培养方法来培养构建的CAR-T细胞,观察不同培养条件下的构建CAR-T表达效率,然后使用培养的CD19-CAR-T细胞杀伤CD19阳性血液肿瘤细胞及对照细胞,观察杀伤性细胞因子的分泌及其靶向性杀伤作用,对CAR-T细胞在体内外抗CD19阳性血液肿瘤的作用进行初步研究。研究方法确定CD19单抗的单链可变区片段、CD137共刺激分子及CD3-δ链序列,使用基因工程方法将其整合成一个整体序列,即CD19-CAR。然后将CD19-CAR片段克隆到慢病毒载体pc DNA?3.1(+)上,选用的插入酶切位点是Nhe I/Bam HI。然后将穿梭质粒和包装质粒(p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G)和pc DNA?3.1(+)目的质粒共培养并转染293T细胞,制备成慢病毒,使用DNA测序及流式检测构建慢病毒序列是否正确。进而使用慢病毒对活化T细胞进行感染,使用加有IL-15或不加IL-15的无血清培养基培养CD19-CAR-T细胞,利用流式细胞术检测CD19-CAR-T细胞的生长表达情况、细胞内细胞因子的表达。结果DNA测序表明慢病毒基因序列构建正确,通过荧光显微镜及稀释倍数测定制备的慢病毒滴度约为2×108TU/ml。转染慢病毒后(本身表达EGFP)的T细胞加Fc-APC抗体检测,EGFP荧光/Fc-APC双阳性,流式结果表明CD19-CAR-构建成功可以在细胞膜表面表达。加入低浓度的IL-15的CAR-T表达率为45%,未加入IL-15的CAR-T表达率为9%。CD19-CAR-T细胞与293T细胞共培养后IL-2、TNF-α杀伤细胞因子分泌量分别为1.89%和0.2%,CD19-CAR-T细胞与CD19-K562共培养后上述2种细胞因子的分泌量分别为30.1%和32.49%。结论CD19-CAR序列构建正确并成功表达,低浓度的IL-15可以促进CAR-T细胞的生长及其表达,转染后的CAR-T细胞可以靶向性识别CD19阳性的靶细胞并引起IL-2、TNF-α细胞因子大量释放,为CAR-T用于临床治疗提供部分实验基础。