合成生物学是指按照一定的规律和已有的知识,一方面设计和建造新的生物零件、装置和系统,另一方面重新设计已有的天然生物系统,并且通过往细胞内植入适当的生物控制元件达到增加新功能的目的。目前,研究者们提出利用极端微生物调控基因建立抗逆性元器件以期提高工农业微生物对逆性环境的耐受性、改善生产工艺、提高生产效率以及降低生产成本。Pyrococcusfuriosus生存于极端环境中,过量表达分子伴侣蛋白是其应对极端环境的主要机制之一。分子伴侣蛋白是一类在序列上没有相关性,在细胞内帮助其他含多肽的结构进行正确组装并在组装完毕后与之分离,不构成这些蛋白质执行功能时的组分。P.furiosus拥有简化的分子伴侣系统,目前已经确认的分子伴侣有三种:prefoldin、hsp60、shsp。本实验室前期的研究表明prefoldin能够使大肠杆菌耐受50℃的高温,shsp能够保护酶类不发生热失活等。因此本实验室构建了一系列极端嗜热古菌分子伴侣“模块”,并对其帮助底盘细胞大肠杆菌抵御环境胁迫的功能进行了研究,同时还对这些“模块”的其它生物学功能也进行了探索。本研究首先研究了来源于极端嗜热古菌P.furiosu 中的分子伴侣蛋白系统在帮助外源蛋白进行可溶性表达方面的作用。来源于极端嗜热古菌P.furiosus中的胞外α-淀粉酶(PFA)拥有优良的酶学特性。与工业上广泛应用的热稳定性α-淀粉酶(BLA)相比,PFA具有更高的最适温度(接近100℃)、更好的热稳定性、较低的最适pH(5.5)以及Ca2+不依赖性,这些特性使得PFA更能满足淀粉水解工业的需求,因此具有更高的应用价值。由于P.furiosus的培养条件非常苛刻,获得大量的PFA只能依靠重组表达。但是PFA在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,不能直接应用于工业生产。研究者们尝试了很多方法以期获得可溶性的PFA,但是这些方法获得的酶活性普遍很低。本实验室尝试利用同源的分子伴侣蛋白帮助PFA在大肠杆菌中进行可溶性表达并提高其酶活力,因此构建了一系列含有分子伴侣蛋白基因的重组质粒,并分别将这些质粒与PFA基因在大肠杆菌中进行共表达,通过测定PFA的酶活性以及蛋白质电泳等方法观察分子伴侣对PFA可溶性表达的影响。结果发现P.furiosus中所有的分子伴侣对PFA的可溶性表达有不同程度的促进作用,且prefoldin对PFA可溶性表达以及酶活性的促进作用最明显。同时,提高分子伴侣的表达量能够进一步增加PFA可溶性表达的比例以及酶活性。渗透物处理也可以增加PFA可溶性表达组分的含量,但对PFA酶活性的提高没有帮助。对来源于P.furiosus中的prefoldin以及来源于大肠杆菌中的GroEL/ES系统在帮助PFA进行可溶性表达的研究发现大肠杆菌的分子伴侣GroEL/ES系统对PFA的可溶性表达以及酶活性的提高有一定的促进作用,但其效果远不如prefoldin。其次,考察了极端嗜热古菌P.furiosus中的分子伴侣系统在帮助大肠杆菌抵御由氨基糖苷类抗生素(Str)处理引起的细胞内蛋白质错误翻译方面的作用以及耐受氧化环境方面的作用。翻译高保真度的维持对于所有生命系统都至关重要。翻译保真度的轻微降低会引起小鼠严重的神经障碍而且严重的错误翻译会引起细菌的生长停滞乃至细胞死亡。错误翻译的蛋白质更容易发生错误折叠进而形成蛋白沉淀。目前人类的很多神经退行性疾病例如老年痴呆以及帕金森等都与蛋白质的错误折叠与聚集有关,研究如何降低细胞内蛋白质错误折叠所引起的蛋白质聚集对于治疗人类疾病有重要的参考价值。链霉素作用于核糖体30S亚基并引起氨基酸错误植入,蛋白质错误翻译的累积会引起细胞内蛋白质发生沉淀从而损伤细胞功能甚至引起细胞死亡。有很多实验证据表明,大量的蛋白质错误翻译会引起分子伴侣蛋白的过量表达,这暗示了分子伴侣可能对错误翻译的蛋白质有重折叠作用。为了研究极端嗜热古菌的分子伴侣系统是否能够帮助宿主细胞抑制由蛋白质错误翻译所引起的沉淀,将含有P.furiosus分子伴侣蛋白的重组质粒在大肠杆菌中进行过量表达,并用不同浓度的链霉素处理细胞研究分子伴侣是否能够帮助细胞抵御链霉素引起的蛋白质错误翻译。结果发现来源于P.furiosus中的prefoldin以及hsp60从不同的方面帮助大肠杆菌耐受链霉素。Prefoldin的过量表达能够促进细胞的生长、拯救细胞膜电势、降低细胞内ROS的含量;而hsp60的过量表达能够促进细胞生长、提高细胞的存活率;同时还发现prefoldin以及hsp60能够有效地抑制由链霉素处理引起的蛋白质沉淀。对来源于大肠杆菌的分子伴侣系统GroEL/ES在帮助大肠杆菌抵御链霉素方面的研究表明,GroEL/ES对宿主菌的保护作用随着链霉素浓度的增加而减弱,而且细胞内蛋白沉淀的含量随着链霉素浓度以及处理时间的增加而增加尤其是分子伴侣本身。最后我们对两种来源的分子伴侣在帮助大肠杆菌抵御氧化环境方面的作用进行了研究。结果发现,两种来源的分子伴侣对两种氧化剂甲萘醌以及白花丹素都有一定的抵御能力,但来源于P.furiosus的hsp60抗氧化剂的能力最强。最后,对来源于极端嗜热古菌中P.furiosus的分子伴侣系统对于提高P450酶催化吲哚合成靛蓝及其生物转化率的影响进行了研究。P450酶催化大量的内源与外源有机底物发生氧化反应,其最广泛的作用在于分解人体内异源性物质(包括药物),帮助昆虫抵御植物毒性以及在细菌与真菌中参与抗生素类物质的合成。目前对P450的应用主要在制药领域,主要是在代谢物合成(药物合成)方面的应用,例如青蒿素以及紫穗槐-4.11-二烯的合成等。P450 BM3是一类来源于巨大芽孢杆菌的P450酶类,该酶的P450结构域(BMP)连接了一个还原酶结构域(BMR)使其获得更有效的电子转运速率以及更高的催化活性,而且P450 BM3可以在大肠杆菌中以可溶性的形式表达,该酶只需要NADPH以及氧便能发挥功能,这些特性使其成为突变体研究以及合成生物学研究的目标。对P450BM3的蛋白质工程研究表明其突变体可使P450催化更多底物、对新底物表现出区域与对映体选择性以及对新底物有更高的选择性以及活性。我们对来源于巨大芽孢杆菌P450BM3酶的四个位点进行了突变:A74G、F87V、L188Q、D168H,该突变体能够以吲哚为底物并催化其合成靛蓝,但该突变体在大肠杆菌中合成靛蓝的产量极低。为了研究分子伴侣蛋白是否能够提高靛蓝的生物转化率,将构建好的分子伴侣蛋白重组质粒与P450 BM3在大肠杆菌中进行共表达,以观察分子伴侣是否能够促进靛蓝的合成。结果发现,含有P.furiosus分子伴侣prefoldin的菌种中,靛蓝的合成量最高,进一步提高分子伴侣的表达量对于靛蓝合成量的提高没有帮助。同时对两种来源的分子伴侣:来源于P.furiosus的prefoldin以及来源于大肠杆菌中的GroEL/ES系统对于靛蓝合成量的研究表明:与prefoldin相比,GroEL/ES能够进一步提高靛蓝的合成量。而且提高底物(吲哚)浓度无法提高靛蓝的合成量甚至会使其合成量降低。通过对P450 BM3进行CO定量以及体外酶活性测定发现,单独表达P450 BM3酶的菌种中,其酶量以及体外酶活性都较高,但是细胞内的靛蓝产量却非常低,这说明酶量不是限制靛蓝合成的因素。因此,我们对限制靛蓝合成的因素进行了初步的研究,发现细胞内NADPH/NADP+的比率可能会影响产物的合成量。过量表达prefoldin以及GroEL/ES的菌种中NADPH/NADP+比率较高,而该比率高时有利于靛蓝的合成。GroEL/ES从两个方面来提高靛蓝的合成量:调节细胞内NADPH/NADP+比率以及增加P450BM3可溶性表达组分的含量。而prefoldin对该酶可溶性表达无明显的促进作用。