论文部分内容阅读
第一部分sM8α真核表达载体的构建、扩增、测序鉴定及体外表达验证目的：检测前列腺癌三系LNCaP、PC-3、DU145细胞中sM8α的表达,并构建sM8α真核表达载体(pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒)并进行测序。测序鉴定成功后,将pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒转染雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞,为研究sM8α对前列腺癌肿瘤生物学行为的影响提供实验基础。方法：1)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测前列腺癌三系LNCaP、 PC-3、DU145细胞中sM8α的表达,通过高保真PCR获得sM8a-His片段,通过双酶切和T4连接酶构建pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒,进行测序后,与pubmed上的基因序列进行比对。2)传代培养293T细胞,并将pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒及空载对照质粒分别转染到293T细胞中,48h后western-bloting鉴定sM8a-His融合蛋白表达。结果：RT-PCR检测到sM8a mRNA在三种前列腺癌细胞中低表达。成功构建pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒并且测序完全正确。pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒瞬转293T细胞后,western-bloting检测到sM8a-His融合蛋白的表达。结论：pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒能在真核细胞293T细胞内成功表达sM8a-His融合蛋白,为探讨sM8a在前列腺癌肿瘤生物学行为的作用提供基础。第二部分sM8α对前列腺癌LNCaP细胞体外肿瘤生物学行为的影响目的：将pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒及其空载质粒稳定转染前列腺癌细胞系LNCaP细胞,上调sM8a蛋白的表达后,检测其过表达对LNCaP细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移与侵袭性的影响及过表达sM8a-His融合蛋白在细胞内的定位。方法：雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP培养于六孔板中,按照G418终浓度300ug/ml、400ug/ml、500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml培养,筛选出最佳G418浓度。体外培养LNCaP细胞于六孔板中,将细胞分为三组：正常组、对照组、实验组。处理方法分别为不加质粒、转染空载对照质粒、转染pcDNA3.1(-)-sM8a-His质粒。采用脂质体法转染后,用最佳G418浓度筛选,RT-PCR和western blot鉴定稳转细胞。采用MTT法检测实验组和对照组的第一天至第五天的细胞增殖情况,绘制生长曲线。流式细胞术检测细胞周期和饥饿诱导24h后细胞的凋亡率。Transwell法检测LNCaP细胞的迁移和侵袭能力。量子点法检测过表达的sM8a-His融合蛋白在LNCaP细胞中的定位。结果：细胞筛选发现最佳G418浓度为700ug/ml.鉴定稳转细胞成功,与正常组和对照组相比,实验组过表达sM8a蛋白后,细胞生长无明显变化,细胞周期无明显变化,饥饿状态诱导的细胞凋亡率降低,增加了前列腺癌LNCaP的迁移和侵袭能力,过表达的融合蛋白定位于胞浆中。体外实验证明sM8α在肿瘤的迁移和侵袭及抗凋亡作用中有重要意义。结论：sM8a能调节LNCaP细胞的迁移浸润能力,在抗凋亡过程中发挥作用。过表达sM8a定位在胞浆中。第三部分前列腺癌LNCaP细胞中sM8α和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系目的：了解MAPK信号通路的p38、JNK、ERK三个蛋白及其磷酸化蛋白、MNP2、MMP9、全长TRPM8在高表达sM8a的LNCaP细胞中的作用。方法：培养正常LNCaP细胞、LNCaP-NC、LNCaP-sM8a细胞,收集足够的细胞后,加入细胞裂解液和磷酸化酶抑制剂,超声破碎后,离心取上清蛋白,采用western-bloting对蛋白表达量进行检测。结果：p-JNK蛋白在高表达sM8α的LNCaP细胞中表达下调,MMP2在LNCaP-sM8a细胞中被激活,总的p38、JNK、ERK及磷酸化p38、ERK蛋白及MMP9、全长TRPM8蛋白表达无明显差异。结论：JNK/MAPK信号通路在sM8α过表达的细胞中发挥了重要作用,且MMP2的激活对前列腺癌细胞侵袭迁移能力的增加有重要意义。