目的:柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus group B,CVB）是病毒性心肌炎最主要的病原,50%以上的心肌炎由该病毒感染引起,部分患者发展为慢性心肌炎和扩张性心肌病,以CVB3感染最常见。目前尚无有效的预防方法。VP1是CVB3的主要中和抗原,以质粒为载体构建的CVB3 VP1核酸疫苗肌肉注射免疫小鼠后,仅可诱导产生低效价的中和抗体,不能有效阻止致死量病毒感染。为了增强疫苗的效果,一些研究者将树突细胞趋化因子基因与目的基因拼接,构建成靶向核酸疫苗。靶向核酸疫苗有利于抗原的摄取、加工和提呈,并使树突细胞表达协同刺激分子,使无免疫原性的肿瘤抗原或免疫原性较弱的病毒抗原免疫原性明显增强。MDC是CC型趋化因子,能趋化单核/巨噬细胞、树突细胞和T细胞等。本室前期经适当接头序列构建了带有信号肽的MDC与VP1融合基因核酸疫苗pcDNA3/MDC-VP1,免疫小鼠显示对致死量病毒感染的保护作用明显增强,但仍不能完全保护小鼠抵抗致死量病毒感染。与质粒载体相比,腺病毒载体具有进入宿主细胞的能力强、宿主范围广、感染细胞后使协同刺激分子表达上调、诱导细胞因子和趋化因子产生、外源基因高表达以及病毒滴度高等特点,并且不整合到宿主染色体中,无插入突变性。在疫苗载体选择中表现出优势。一些研究显示以腺病毒为载体构建的疫苗有满意的免疫效果。本课题利用AdEasy腺病毒载体系统构建、包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1,单独或与质粒pcDNA3/MDC-VP1联合免疫以增强VP1抗原的免疫效果。方法:1重组穿梭质粒的构建将质粒pcDNA3/MDC -VP1用限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切,回收目的片段MDC-VP1后与经同样酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,经转化、筛选和酶切鉴定,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/MDC-VP1。2重组腺病毒质粒的构建将pAdTrack-CMV/MDC -VP1质粒用内切酶PmeⅠ线性化,利用AdEasy系统,经两步法在大肠杆菌BJ5183中与骨架载体pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1。用PacⅠ酶切鉴定,将阳性质粒转化感受态E.coli DH5α,挑取阳性克隆。以碱裂解法大量提取重组质粒,并用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）沉淀法进行纯化。3重组腺病毒的包装与扩增重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1用内切酶PacⅠ线性化,以阳离子脂质体法转染HEK293细胞,并观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达。冻融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染HEK293细胞,进行第二轮扩增,同法进行第三、四轮大量扩增,大量收集第四代病毒液,用腺病毒纯化试剂盒进行纯化。4重组腺病毒滴度测定待HEK293细胞在96孔板中生长至70⁸0%汇合时,以不同稀释倍数的各代病毒液及纯化后病毒液感染细胞,培养48小时后,以GFP阳性细胞计数法测定病毒滴度。病毒滴度=荧光细胞数×病毒液的稀释倍数/病毒液量。5同法扩增并纯化本室前期构建的Ad,并测定病毒滴度。6第3代Ad/MDC-VP1病毒感染HEK293细胞后48小时,分别收集细胞及上清,用Western blot法检测病毒蛋白的表达。7用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/MDC-VP1,用聚乙二醇沉淀法进行纯化。8动物实验:将6⁸周龄雄性BALB/c小鼠随机分为6组,股四头肌注射质粒或重组腺病毒。Ad/MDC-VP1组（A组）:每次1.2×107pfu/100μl,免疫2次,间隔2w;pcDNA3/MDC-VP1组（B组）:每次100μg/100μl,免疫3次,间隔3w;pcDNA3/MDC-VP1+Ad/MDC-VP1组（C组）:免疫3次,初次接种质粒,间隔3w后接种Ad/MDC-VP1加强2次,间隔2w,剂量同上;Ad/MDC-VP1+pcDNA3 /MDC-VP1组（D组）:免疫3次,前两次接种Ad/MDC-VP1,间隔2w,第3次接种pcDNA3/MDC-VP1,间隔3w,剂量同上;Ad组（E组）:免疫两次,间隔2w,剂量同上;PBS组（F组）:每次100μl,免疫3次,间隔3w。每次免疫后第14天,内眦静脉取血,分离血清,用ELISA检测血清CVB3 VP1特异性IgG水平;用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体水平;末次免疫后3周,每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液,用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）进行淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）杀伤活性的检测;每组另取3只小鼠用3LD₅₀CVB3攻击,注射病毒后第7天采血,用于血中病毒滴度的测定;每组剩余12只小鼠用致死量的CVB3(4LD₅₀)进行腹腔注射,观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天。结果:1成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/MDC -VP1,限制酶切分析证明符合预期设计。2成功构建重组腺病毒质粒pAd/MDC-VP1,用PacⅠ酶切得到约30kb的片段和一个4.5kb的小片段。3转染48小时后,荧光显微镜下可观察到HEK293细胞报告基因GFP的表达,重组腺病毒Ad/MDC-VP1包装成功。初代病毒液再次感染HEK293细胞,在荧光显微镜下可观察到逐日明显的细胞病变和荧光聚集,各代病毒液感染细胞后均有彗星样荧光斑块形成。4重组腺病毒Ad/MDC-VP1初代至第四代病毒滴度分别为:2.2×10³ pfu/ml、1.3×10⁴ pfu/ml、4×10⁶ pfu/ml和5.8×10⁸ pfu/ml。5重组腺病毒Ad/MDC-VP1三代病毒液感染HEK293细胞48h后,分别提取上清和细胞总蛋白,Western Blot检测显示上清中有表达的融合蛋白MDC-VP1。6各次免疫后血中CVB3 VP1特异性IgG平均水平分别为:A组:1:75.78,1:527.72;B组:1:66.07,1:199.99,1:459.41;C组:1:65.97,1:229.72,1:696.31;D组:1:65.98,1:459.41,1:1392.52;E组和F组均未检测到。单因素方差分析表明除E、F组外,各组VP1特异性IgG逐次增加（P<0.01）;末次免疫后各组比较,抗体滴度由高到低依次为:D组>C组>A组>B组（P<0.05）。7各次免疫后血中CVB3平均中和抗体水平分别为:A组:1:8.41,1:53.38;B组:1:7.07,1:25.2,1:50.39;C组:1:7.49,1:28.28,1:67.26;D组:1:8.41,1:50.39,1:71.26;E组和F组均未检测到。单因素方差分析表明除E、F组外,各组CVB3中和抗体水平逐次增加（P<0.01）;第2次免疫后抗体滴度由高到低依次为:A组>D组>C组>B组（P<0.05）,末次免疫后各组间比较差异无统计学意义。8小鼠脾淋巴细胞增殖试验分别以灭活的CVB3和刀豆蛋A（concanavalin A,ConA）体外刺激淋巴细胞,检测细胞增殖活性。单因素方差分析表明,以CVB3刺激时,各组间比较无统计学意义;以ConA刺激时,C、D组明显高于其他各组（P<0.01）。9小鼠脾脏特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明,各组杀伤率由高到低依次为C>D>A>B>E>F,两两比较除C和D、D和A差异无统计学意义外,其它各组差异均有统计学意义（P<0.05）。10 3LD₅₀CVB3攻击小鼠后第7d血中病毒滴度测定结果表明A、B、C、D组明显降低,各组间两两比较表明C、D组明显低于B组（P<0.05）。11 4LD₅₀CVB3攻击小鼠后21d生存率分别为:D组:41.7%,C组:33.33%,A、B组:25%,E、F组无存活,经过Kaplan-Meier生存分析表明各组生存时间有差别（P<0.01）。结论:1成功构建并包装重组腺病毒Ad/MDC-VP1,能在HEK293细胞中表达MDC-VP1融合蛋白并分泌到细胞培养液中。2重组腺病毒疫苗Ad/MDC-VP1免疫2次后能提高小鼠体液免疫应答,增强非特异性淋巴细胞增殖活性及特异性CTL杀伤活性,且能降低病毒攻击后的小鼠血中病毒滴度。3重组腺病毒疫苗与核酸疫苗联合应用,体液免疫水平、非特异性淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性明显高于单独免疫组。4当致死量病毒攻击小鼠后,核酸疫苗与腺病毒载体疫苗联合应用能明显延长小鼠生存时间。