论文部分内容阅读
目的：用改良方法分离、培养及鉴定大鼠肝星状细胞(Hepaticstellatecells，HSCs)，观察白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukinⅠreceptorantagonistIL-1ra)对HSCsⅠ型胶原(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ，Col-Ⅲ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissueinhibitorofmetalloproteinase1，TIMP-1)基因表达的影响，初步探讨IL-1ra对HSCs产生Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及TIMP-1mRNA作用的可能机制，为临床治疗和/或预防肝纤维化提供实验性理论依据。
方法：取体重为480g的Wistar大鼠1只，禁食禁水12小时，以2％戊巴比妥钠腹腔麻醉，固定于手术台上。常规消毒，以十字切口切开腹腔，翻出肠管，充分暴露门静脉，用留置针头穿刺门静脉，固定，退出针芯，接通灌注系统。先用预灌注液(已预温至37℃)进行灌注。然后迅速剪断后腔静脉，以每分钟10ml的速率缓慢灌注约十分钟，当整个肝脏变成黄色时，换用已预热至37℃含Ⅳ型胶原酶(CollagenaseTypeⅣ)溶液灌注，至整个肝脏几乎呈液状。此时，小心将肝脏从大鼠腹腔中切除，将其置于无菌培养皿中，转入超净工作台进行操作。首先将肝脏组织撕碎，去除肝包膜及结缔组织，剪碎肝组织，倒入一预先装有50ml振荡消化液三角烧瓶，再加入含0.6g/LCaCl2的D-Hanks液至100ml。将三角烧瓶放入恒温振荡器，振荡消化30分钟(200r/min，37℃)，所得细胞悬液依次经150目、200目金属网过滤，将滤液平均收集于两个容量为50ml的离心管中。500×g离心7分钟，弃上清。每管加入40ml1640培养液，反复吹打，使细胞充分混匀。50×g离心2分钟(20℃)，反复两次，弃沉淀。上清液500×g离心7分钟(20℃)，弃上清，沉淀用1640培养液500×g离心冲洗两次。将两管细胞沉淀合并，分别加入1640液12ml、330g/LNycodenz液6ml，充分混匀，将细胞悬液分装入两个10ml的离心管。在细胞悬液上小心滴加一层1640培养液，1500×g离心15分钟(20℃)。将1640液与细胞悬液交界面间的细胞吸出，用1640液500×g离心7分钟(20℃)，冲洗两次。然后将细胞悬浮于含20％(体积分数)胎牛血清1640培养基中，移至细胞培养瓶，放入37℃、5％CO2(体积分数)培养箱中进行培养。用荧光显微镜观察新鲜分离的HSCs，HSCs在波长为328nm荧光显微镜下能自发的发出蓝绿色荧光。用Desmin免疫细胞化学染色法鉴定所分离的HSCs。将分离的HSCs以1×109/L浓度接种于150ml培养瓶中，培养24小时后换液，2～3天传代一次。用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基配成单个细胞悬液，以每孔103个细胞接种孔培养板中，每孔体积200μl。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，培养24小时。然后加入不同浓度的IL-1ra，3孔重复。另外，以只含1640培养液孔作为空白对照组。继续培养48小时后，每孔按培养液量的10％既20μl加入MTT(浓度为5mg/ml)溶液，继续培养4小时后，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚枫(DimethylsulfoxideDMSO)。然后在振荡器上振荡10分钟，使吸附在细胞上的蓝色结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定光吸收值，测定波长为490nm，以只加1640培养液的孔为空白对照组，记录结果。细胞存活率=实验组吸收值/对照组吸收值×100％。选择HSCs细胞存活率在90％以上IL-1ra的浓度作为试验所需的浓度。取处于对数生长期的HSC，以1×105的密度接种于含10％胎牛血清的200ml培养瓶，在37℃、5％CO2(体积分数)培养箱中培养24h，加入预先配制好的IL-1ra溶液，使其达到实验所需的浓度。低浓度组：加入配制好的IL-1ra溶液，使其最终浓度为1ng/ml；中浓度组：加入配制好的IL-1ra溶液，使其最终浓度为10ng/ml；高浓度组：加入配制好的IL-1ra溶液，使其最终浓度为100ng/ml。用浓度分别为1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml三个浓度梯度分别作用于大鼠的HSCs48小时，提取总mRNA，然后进行逆转录，用实时荧光定量聚合酶链反应(RealTime-PCR)方法检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA的表达。在体外观察IL-1ra对HSCs中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA表达的影响。
结果：对照组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、2.70±0.57、3.83±0.30。而分别加入1ng/ml、10ng/ml、100ng/mlIL-1ra后Col-Ⅰ基因表达水平依次为1.34±0.35、0.86±0.19、0.35±0.03；Col-Ⅲ基因表达水平依次为2.02±0.29、1.13±0.09、0.47±0.11；TIMP-1mRNA的表达水平依次为3.12±0.25、2.53±0.38、1.98±0.18，与对照组比较，不同浓度处理组IL-1raHSCsCol-Ⅰ、Col-Ⅲ和TIMP-1mRNA的表达显著降低，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。
结论：改良的肝星状细胞分离方法简便、适用；IL-1ra以剂量依赖方式抑制HSCs中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及TIMP-1mRNA的表达。