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猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)有2种基因型,分别为PCV1和PCV2,其中PCV1不致病,可以长期感染PK-15细胞,早期被认为是一种细胞污染物。而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原,还可导致猪繁殖障碍(reproductive failure)、猪皮炎与肾病综合症(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)和呼吸道疾病综合症(Porcine respiratory disease syndrome, PRDS)等疾病,这些疾病通常被称为与PCV2相关性疾病(PCVAD).自发现PMWS疾病后,PCV2带来的疾病已经给养猪业带来了巨大的损失。本实验旨在建立荧光定量PCR及间接免疫荧光这两种检测方法检测PCV2。主要内容及结果如下：(1)重组质粒pMD-ORF2的构建根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计一对引物,在引物上游引入BanH I酶切位点,下游引入Hindlll酶切位点。用PCR扩增出PCV2DNA中ORF2片段(全长为702bp),然后将此基因片段连接到pMD20-T载体,经PCR、酶切鉴定后,筛选出重组质粒pMD-ORF2。(2)PCV2荧光定量PCR检测方法的建立根据PCV2ORF2基因序列中的保守片段设计一对特异性的引物及TaqMan探针。以重组质粒pMD-ORF2为模板,通过条件优化,以定量的10倍稀释梯度的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立PCV2的荧光定量PCR检测方法。结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×101拷贝/1μL,比普通PCR的灵敏度高出100倍,说明该方法具有良好的准确性和灵敏度。PK-15细胞是PCV2体外增殖的常用宿主细胞,PCV2虽然可以在体内长期以高滴度存在,但在体外培养中其增殖滴度反而较低且不稳定。因此本实验为提高PCV2在体外培养滴度,从收毒时间、是否添加D-氨基葡萄糖、培养的稳定性及培养系统四个方面进行初步探讨,在实验中发现接毒的细胞可以不需要D-氨基葡萄糖处理；接毒后72h收获的PCV2病毒拷贝数明显高于24h及48h收获的病毒拷贝数；因为PCV2的毒价和稳定性不够,所以选择在细胞上连续传代,直至第四代后,病毒的拷贝数才趋于稳定并随之增加,同时在实验中还发现PCV2有很强的宿主依赖性；在小方瓶、转瓶及微载体三种培养系统中,转瓶及微载体培养后的PCV2TCID50可以高达10-7/mL。