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外源暴露诱导的慢性肝脏炎症涉及肝组织坏死和局部炎性反应,可进一步导致肝脏纤维化和肝硬化,已成为重要的公共卫生学问题之一。得益于肝脏独特的血窦结构和丰富的免疫细胞亚群,外源因素通过诱导肝细胞与肝内免疫细胞的细胞间互话,促进肝脏局部免疫微环境的形成,介导肝脏炎性损伤。其中,具有肝脏驻留表型的枯否细胞(KC)占体内组织巨噬细胞的80%～90%,可快速响应肝内危险信号。NLRP3炎症小体是广泛存在于胞浆中诱导促炎性因子产生的蛋白复合物,可在多种内、外源性危险信号诱导下,发生具有免疫原性的细胞焦亡;既释放损伤相关模式(DAMPs)促进细胞间通讯,也分泌白介素(IL)-1β等炎性因子激活免疫级联反应,与肝脏炎性损伤密切相关。环氧合酶2(COX-2)可被外源因素或促炎细胞因子诱导表达,如黄曲霉毒素B1(AFB1)可诱导大鼠肝组织COX-2高表达;研究表明,干预COX-2可通过减少线粒体氧化损伤,抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中NLRP3在线粒体上的组装与活化。然而,内质网(ER)驻留蛋白COX-2如何移位至线粒体并调控NLRP3炎症小体的活化,仍待进一步研究。目的:通过建立AFB1诱导肝细胞COX-2高表达和肝脏炎性损伤的模型,探明COX-2的表达、分布与降解参与调控AFB1诱导的NLRP3依赖性肝细胞焦亡的ER质量控制(ERQC)机制;探讨肝细胞焦亡所释放的DAMPs激活免疫级联效应的肝脏局部免疫调控机制;结果为筛查AFB1诱导肝脏炎性损伤的干预靶点提供线索和理论依据。方法:(1)GEO分析:采用GEO数据库(GSE25844),分析AFB1处理HepaRG细胞中PTGS2、caspase相关细胞死亡基因的mRNA水平及其相关性。(2)体内试验:采用AFB1(1 mg/kg)隔天灌胃C57BL/6小鼠4周建立暴露模型、采用COX-2的选择性抑制剂塞来昔布(CELE,30 mg/kg)建立干预模型。小鼠血清样本和肝组织样本等进行如下检测:①检测血清和肝组织匀浆中AST和ALT等肝功能指标;②流式细胞仪(FCM)分析肝脏非实质细胞中F4/80+KC的比例改变;③H&E染色观察肝组织病理学改变;④天狼星红染色观察肝组织胶原沉积;⑤实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中Ⅰ相代谢酶(Cp1a2,Cyp3a11)、Ⅱ相代谢酶(Gsta,Gstm,Gstt)、炎性因子(Il1b,Il18,Il6,Tnfa)和Ptgs2的mRNA水平;⑥蛋白免疫印迹(WB)检测肝组织COX-2、NLRP3炎症小体(p65,NLRP3,ASC)和焦亡(p10,IL-1β,GSDMD)相关蛋白的水平;⑦免疫组化(IHC)观察肝组织中COX-2和caspase 1的表达与分布;⑧酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清和肝组织匀浆中IL-1β的分泌。(3)离体试验:采用两步肝灌流法和免疫磁珠法分离小鼠原代肝细胞和KC,体外培养48h后收集样本,或给予AFB1(1μM,24 h)、CY-09(1μM,24 h)处理。①WB检测细胞中COX-2、促炎信号传导相关蛋白(AP-1,c-JUN,STAT3)、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白;②ELISA检测上清中IL-1β的分泌。(4)体外试验:采用诱导分化的永生化人肝祖细胞系HcpaRG细胞给予AFB1(1μM,24 h)建立暴露模型。①qRT-PCR检测Ⅰ相代谢酶的mRNA水平;②焦亡相关指标:透射电子显微镜(TEM)观察焦亡小体和细胞质膜破裂,激光共聚焦(confocal)显微镜免疫荧光(IF)技术检测GSDMD的表达,WB检测焦亡相关蛋白,FCM检测caspase 1和PI双阳性的焦亡细胞比例,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜完整性,ELISA检测上清中IL-1β的分泌;③NLRP3炎症小体相关指标:WB检测NLRP3炎症小体相关蛋白,IF检测NLRP3的表达及其与线粒体的共定位;④ER氧化还原相关指标:化学发光法检测胞内总ROS的水平,WB检测ER氧化还原(ERO1 α,PDI)和未折叠蛋白反应相关蛋白;⑤免疫共沉淀(Co-IP)检测COX-2与NLRP3或B55δ的蛋白相互作用;⑥采用NLRP3特异性抑制剂CY-09建立干预模型,检测NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑦采用COX-2的小干扰RNA(siPTGS2)建立基因干预模型,检测COX-2的表达、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑧采用siERO1A或高表达质粒建立ERO1α的高低干预模型,检测ERO1α与COX-2的表达及分布、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑨采用siPPP2R2D建立B55δ的基因干预模型,检测B55δ与COX-2的相互作用及分布、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标;⑩采用永生化人正常肝L02细胞,靶向COX-2的丝氨酸(S)582、583、584、586或601位点,构建模拟高磷酸化(D)或低磷酸化(A)的细胞株,检测COX-2的表达及分布、NLRP3炎症小体和焦亡相关指标。结果:(1)GEO分析:通过数据库挖掘分析,与对照组相比,AFB1处理HepaRG细胞中PTGS2和CASP1的mRNA水平显著升高,并且两者呈显著正相关。(2)体内试验:与对照组相比,AFB1处理组小鼠肝组织:①AST和ALT含量升高;②F4/80+KC的比例增加(5.4%至16.57%,P<0.05);③炎性灶数量增加;④胶原沉积增加;⑤I相代谢酶、炎性因子和Ptgs2的mRNA水平增高,II相代谢酶降低;⑥COX-2、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白升高;⑦COX-2和caspase 1的阳性染色增多;⑧IL-1β分泌增加。与AFB1处理组相比,CELE干预联合AFB1处理组小鼠中上述指标得到挽救。(3)离体试验:①与对照组小鼠相比,AFB1处理组原代肝细胞和KC中COX-2、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白升高,上清IL-1β分泌增多。②在原代肝细胞-KC体外共培养模型中,与对照组小鼠相比,AFB1增强肝细胞中上述现象;与AFB1处理组小鼠相比,CY-09降低肝细胞中上述现象。③在未处理小鼠的原代肝细胞-KC体外共培养模型中,与原代肝细胞单层培养相比,AFB1增强肝细胞中上述现象。(4)体外试验:与对照组HepaRG细胞相比,AFB1处理组中①I相代谢酶的mRNA水平升高;②细胞出现焦亡小体和质膜破裂,GSDMD的荧光信号增强,caspase 1和PI双阳性细胞比例增加(7.18%至19.22%,P<0.05),焦亡相关蛋白表达增强,上清中LDH释放和IL-1β分泌增加;③NLRP3炎症小体相关蛋白表达增强,NLRP3与线粒体或ASC的共定位增加;④总ROS水平升高,ER氧化还原和未折叠蛋白反应相关蛋白表达增强;⑤COX-2-NLRP3、COX-2-B55δ的蛋白相互作用增强。与AFB1处理组HepaRG细胞相比,⑥CY-09联合AFB1干预组中caspase 1和PI双阳性细胞比例减少(19.22%至10.67%,P<0.05),上清中LDH释放和IL-1β分泌减少;⑦siPTGS2联合AFB1干预组中NLRP3与线粒体的共定位降低,COX-2、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白表达降低,上清中LDH释放和IL-1β分泌减少;⑧siERO1A联合AFB1干预组中ATF4的入核减少,NLRP3与线粒体的共定位降低,ERO1α、COX-2、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白表达降低,上清中LDH释放和IL-1β分泌减少;⑨siPPP2R2D联合AFB1干预组中NLRP3与线粒体的共定位降低,B55δ、NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白表达降低,上清中LDH释放和IL-1β分泌减少,COX-2-Derlin 1的蛋白相互作用增强。⑩与L02-pBabe细胞相比,L02-COX-2S601A细胞中NLRP3炎症小体和焦亡相关蛋白的表达增强,上清中LDH释放和IL-1β分泌增加;分别对比COX-2各位点的低磷酸化与高磷酸化细胞,仅L02-COX-2S601D细胞中上述现象较L02-COX-2S601A细胞显著降低。结论:本研究阐明了COX-2Ser601去磷酸化激活肝细胞NLRP3依赖性焦亡,经由肝细胞与KC的细胞间通讯,介导肝脏局部免疫依赖性肝脏炎性损伤的分子机制。结果提示COX-2去磷酸化修饰调控AFB1肝毒性的新模式,为筛查COX-2作为外源物诱导肝脏炎性损伤的干预靶点提供理论依据。