原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma, PHC)是人类比较常见的一种恶性肿瘤,在全球范围内的发病率排第五,死亡率排第三。我国是原发性肝癌高发的国家,每年因原发性肝癌死亡的人数有23万之多,占全部恶性肿瘤死亡率近20%,仅次于胃癌位居第二位,在江苏启东及广西扶绥地区原发性肝癌的发病率尤其突出。原发性肝癌具有诊治难、进展快、预后差的特点,严重危害着人们的健康,必须进一步加强原发性肝癌的防治研究。流行病学及动物学实验研究表明,在我国和一些非洲国家,慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染和饮食中黄曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)污染是原发性肝癌高发人群的2个主要危险因素。而且,这两个因素之间能够相互协同,共同促进肝癌的发生发展。AFT是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌所产生的一种代谢产物,化学上属二呋喃香豆素的衍生物。根据其分子结构的不同,天然产生的AFT分为B1、B2、G1及G2四种异构体。在我国,许多的食物、粮油、药品原料、农副产品及其制成品均易被AFT所污染,其中又以黄曲霉素B1(Aflatoxin B1, AFB1)的污染最为广泛,毒理作用也最强。AFB1是目前所知的最强致癌物质之一。研究表明,食物中黄曲霉毒素的含量多少与肝癌的发生呈正相关,这已被许多流行病学实验病理学研究所证实。研究表明,AFB1在没有经过代谢活化之前的母体化合物是无致癌性的,它进入机体后必须通过体内的Ⅰ相药物代谢酶细胞色素P450系统作用,生物代谢活化后才能表现出毒性作用,被吸收的AFB1进入机体后,经Ⅰ相药物代谢酶代谢转化,形成黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1, AFM1)、黄曲霉毒素P1(Aflatoxin P1, AFP1)、黄曲霉毒素Q1(Aflatoxin Q1, AFQ1)及黄曲霉毒素醇,后三者被认为无活性而通过尿液或粪便排泄出体外。而AFM1和AFB1可被细胞色素P450lA2(Microsomal cytochrome P4501A2,CYP1A2)、细胞色素P4503A4(Microsomal cytochrome P4503A4, CYP3A4)代谢活化为能与细胞大分子物质(DNA或蛋白)结合形成活性中间体AFM1-8,9环氧化物(AFM1-exo-8,9-epoxide)及AFB1-8,9环氧化物(AFB1-exo-8,9-epoxide, AFBO)方才具有基因毒性及致癌性。作为催化这一代谢反应的关键酶——细胞色素P450,主要存在于肝细胞内,其中又以CYP3A4的含量最多及活性最高。AFBO能自发和核酸及蛋白质等生物大分子相结合而形成相应加合物。AFB1和DNA共价结合形成AFB1-DNA加合物是引起基因突变的基础,也是导致原发性肝癌发生的第一步。AFB1-DNA加合物主要存在于肝细胞内,除部分被体内Ⅱ相代谢酶如谷胱苷肽转移酶(GST)等作用下转为无毒物排出体外,由于分子内电子场的改变,也可自发形成其它DNA加合物,导致DNA损伤。AFT严重危害着人类的健康,为了防止或者减少其造成的各种危害,除了避免食物被污染及去除毒素等措施外,用各种化学的方法抑制、延迟或者逆转癌变过程,并防止癌症发生的途径也日益被人们所重视。研究发现,一些植物性化学物如叶绿素、茶多酚、黄酮类化合物等在肿瘤化学预防这一邻域有着独特的防癌作用。通过在AFT高污染地区补充植物化学物制剂或其含量较高的食物来预防AFT致肝癌效应的作用越来越受到众多学者的重视。食物及其成分作为化学预防剂具有安全、易接受的优点,是目前开展AFB1相关恶性肿瘤化学预防剂的重点研究领域之一。银杏(Ginkogo biloba L)为银杏科植物,其叶和果均具有重要的药用价值。标准银杏叶提取物(Ginkgo Biloba Extract)被国际通称为EGb761,一般含有24%的黄酮甙类及5-7%的银杏特有的萜烯类。近来研究发现EGb761及其组分可以通过抗氧化、抗血管生成及其基因调节而具有抗癌的作用。因此,目前对银杏叶的药用价值研究已从最初在心、脑血管系统疾病的应用扩展至抗肿瘤领域。前期实验研究证实EGb761对AFB1诱导的大鼠肝癌有抑制作用,但其具体作用机制尚未完全明确。研究发现在实验大鼠肝癌表达的众多基因中,IGF-Ⅱ、P16Ink4a、NADE、GST-Pi及UGT等肿瘤相关基因的表达明显大于正常肝脏,p75NTR、P53、AKR7A及COX-2等基因与大鼠肝癌的关系尤为突出。本研究通过动态观察EGb761在AFB1诱发大鼠肝癌实验过程中对肝脏相关代谢酶及上述肿瘤相关基因表达的影响,进一步探讨EGb761化学阻断大鼠肝癌发生发展中的分子生物学机制。为肝癌防治药物的研制提供更多的实验依据,将有很大的经济及社会效益。方法建立AFB1致PHC大鼠模型：70只雄性4周龄Wistar大鼠适应环境后,按体重随机将其分为3组：AFB1组,25只,喂饲正常饲料,于第4周开始腹腔注AFB1至第52周；EGb761+AFB1组,25只,每天喂饲含2g/kgEGb761饲料至实验结束,腹腔注AFB1剂量及时间同AFB1组；空白对照组,20只,喂饲正常饲料,不给AFB1处理。分别于实验第13周、23周、33周、43周、53周及63周对全部动物进行剖腹肝活检,第73周结束实验,处死全部实验动物。所取肝组织标本分成3块,一块立即制备肝匀浆,分离出肝微粒体进行肝代谢酶CYP3A4及GSH的检测；一块冷冻保存于-80℃,用于检测肿瘤相关基因的表达情况；一块放入10%中性福尔马林溶液内固定后常规石蜡包埋,用于HE染色。采用Real time-PCR及Western Blotting技术相对定量分析IGF-Ⅱ、p16Ink4a、NADE及p75NTR等肿瘤相关基因的表达情况,并对各蛋白表达的相关性进行统计分析。结果1.大鼠肿瘤发生情况：第73周实验结束时,各组有效动物数及肿瘤发生情况如下：AFB1组17只,发生恶性肿瘤13例(76.5%),其中10例为肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),其余为胆管细胞癌2例、纤维肉瘤1例,原发性肝癌发生率为70.6%(12/17)；EGb761+AFB1组17只,发生恶性肿瘤6例(35.3%),其中HCC为5例,胆管细胞癌1例,原发性肝癌发生率为35.3%(6/17)。对照组16只,无肿瘤发生；EGb761+AFB1组肝癌发生率显著低于AFB1组(P<0.01)。2.大鼠肝脏组织形态学变化情况实验过程中,由AFB1诱发的肝脏恶性肿瘤最早出现在第52周,为纤维肉瘤,第一例肝癌的出现在第55周,最早出现肿瘤及第一例肝癌的大鼠均为AFB1组大鼠。镜下动态观察肝活检组织病理切片显示AFB1诱发大鼠肝癌的癌变过程大致可以分为三个阶段,第一阶段(13周～33周),出现不同程度的肝细胞变性；第二阶段(34周～53周)出现异常肝细胞增生灶及增生结节,主要为嗜碱性结节；第三阶段(54周～73周)肝病变进一步加重,逐渐可见癌结节。EGb761+AFB1组大鼠在诱癌各阶段的肝脏损害均较同时段AFB1组要轻,发生增生性病变比AFB1组亦较迟,对照组无上述改变。3.EGb761对肝药酶的影响3.1大鼠肝组织代谢酶CYP3A4活性的变化情况在整个实验过程中,各组大鼠肝组织代谢酶CYP3A4活性在第23周及53周时呈现双波峰变化；CYP3A4酶活性在AFB1组、EGb761+AFB1组,除第13周外,其他时段均高于对照组；AFB1组在第53周及63周时CYP3A4的活性显著于高于EGb761+AFB1组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2大鼠肝组织GSH含量的变化情况在整个实验过程中,AFB1组和EGb761+AFB1组肝组织GSH含量在第13至33周时较正常对照组要低,随着实验的进展,呈现逐渐下降趋势,但AFB1组下降过程明显要快于EGb761+AFB1组,在第43周及53周时差异最明显(P<0.05)。而正常对照组在整个实验过程中各时段的变化并不明显。4.EGb761对大鼠肝癌发生过程中肿瘤相关基因表达的影响4.1EGb761对大鼠肝组织p16Ink4a mRNA及相应蛋白表达的影响在第13周、33周时,各组p16Ink4a mRNA的表达量差异不明显(P>0.05)。至第53、73周时,AFB1组、EGb761+AFB1组p16Ink4a mRNA的表达量均较对照组下调(P<0.05),AFB1组下调最明显,与EGb761+AFB1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在第13周、33周时,p16Ink4a蛋白在各组的表达水平无明显差异(P>0.05)。至第53周、73周时,AFBl组和EGb761+AFB1组中表达量较对照组均有所下调(P<0.05)。p16Ink4a蛋白在EGb761+AFB1组表达水平较同时段AFB1组要高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2EGb761对大鼠肝组织P53mRNA表达的影响P53mRNA的表达量于第13周时在各组大鼠肝组织中均有低度表达,差异不明显；至第33、53及73周时,AFB1组、EGb761+AFB1组的表达量均较对照组上调(P<0.01)；但P53mRNA在EGb761+AFB1组的表达量较同时段AFB1组要高,差异有统计学意义(P<0.01)。4.3EGb761对大鼠肝组织IGF-ⅡmRNA及蛋白表达的影响第13周、33周时,IGF-ⅡmRNA在各组肝组织中均有表达,但无明显差异(P>0.05)；至第53周、73周时,与对照组比较,AFB1组和EGb761+AFB1组中IGF-ⅡmRNA的表达均明显上调(P<0.01)；EGb761+AFB1组中IGF-ⅡmRNA表达水平较同时段AFB1组明显要低,差异有统计学意义(P<0.01)。第13周、33周时,IGF-Ⅱ蛋白在各组肝组织中均为低表达或几乎不表达,无明显差异；至第53周、73周时,IGF-Ⅱ蛋白在AFB1组和EGb761+AFB1组均为高表达,明显高于对照组；且随肝癌的发生发展有逐渐增高趋势；第53周、73周时,EGb761+AFB1组IGF-Ⅱ蛋白表达水平始终低于同期AFBl组,差异有统计学意义(P<0.01)。4.4EGb761对大鼠肝组织NADE mRNA及蛋白表达的影响自第33周开始,NADE mRNA的表达量在AFB1组和EGb761+AFB1组均较同时段正常对照组要高,差异有统计学意义(P<0.05),两组间差异不明显(P>0.05)。第33、53及73周时,AFB1、EGb761+AFB1两组中NADE蛋白的表达量均较正常对照组明显要高,差异有统计学意义(P<0.01)；两组间比较,EGb761+AFB1组表达较AFB1组要高,但差异无统计学意义。4.5EGb761对大鼠肝组织p75NTR mRNA及蛋白表达的影响在实验开始的第13至第33周,各组的p75NTR mRNA表达量差异不明显。到第53周及第73周时,在AFB1组及EGb761+AFB1组中的p75NTRmRNA表达量较正常对照组明显下调(P<0.05)；其中AFB1组下调更为明显,与EGb761+AFB1组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。实验至第53周时开始,p75NTR蛋白在AFB1组及EGb761+AFB1组中的表达量较正常对照组明显下降(P<0.01)；AFB1组p75NTR蛋白表达量较EGb761+AFB1组要低,差异有统计学意义(P<0.05)。4.6EGb761对大鼠肝组织COX-2mRNA表达的影响在实验开始的第13及33周时,COX-2mRNA在AFB1组、EGb761+AFB1组均呈低表达状态,差异无统计学意义；至第53周及73周时COX-2mRNA在AFB1组及EGb761+AFB1组均呈高表达量状态,与正常对照组比较差异明显(P<0.01)；而两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；空白对照组的COX-2mRNA在整个实验过程中,都呈低表达甚至无表达状态。4.7EGb761对大鼠肝组织UGT mRNA表达的影响在实验过程中的第13、33、53及73周时,UGT mRNA在AFB1组及EGb761+AFB1组中表达量均较正常对照组明显上调,差异有统计学意义(P<0.01)；其中UGT在EGb761+AFB1组中的表达量在各时段较AFBl组显著要高,差异有统计学意义(P<0.01)。4.8EGb761对大鼠肝组织AKR7A mRNA表达的影响在实验开始的第13周,AKR7A mRNA的表达量在AFB1组及EGb761+AFB1组中较正常对照组均要明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；第33、53周及73周,EGb761+AFB1组中的表达量要高于AFB1组(P<0.01)。4.9EGb761对大鼠肝组织GST-Pi mRNA表达的影响在整个实验过程中,GST-Pi mRNA的表达量在AFB1组及EGb761+AFB1组中较正常对照组均要明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)；至第33、53周时,AFB1组的表达量要高于EGb761+AFB1组,但无显著性差异(P>0.05)；至第73周,AFB1组的表达量要显著高于EGb761+AFB1组,差异有统计学意义(P<0.01)。5.0p16Ink4a、IGF-ⅡNADE及P75NTR蛋白表达的相互关系在实验第73周、53周及33周时,AFB1组及EGb761+AFB1组中p16Ink4a蛋白的表达与p75NTR蛋白的表达呈显著的正相关关系(P<0.05)。结论1.银杏叶提取物能有效降低AFB1诱发肝癌的发生率,具有防癌作用,可成为人类与AFB1相关性肝癌的化学预防剂。2.在AFB1诱发大鼠肝癌过程中,银杏叶提取物能抑制肝脏Ⅰ相酶CYP3A4的活性,从而减少具有基因毒性及致癌性的AFBO的形成,降低其致癌性。3.银杏叶提取物能提高大鼠肝脏GSH的含量水平,从而提高机体的抗氧化能力,减轻AFB1诱癌过程中自由基所致的脂质过氧化损伤,亦可能是其发挥抗癌作用的机制之一。4.银杏叶提取物在AFB1诱发大鼠肝癌过程中,能够上调抑癌基因p16Ink4a、P53及p75NTR的表达水平,下调肝癌病变相关增殖基因IGF-Ⅱ的表达量,可能是其抗癌作用的分子生物学基础之一。5.银杏叶提取物在AFB1诱发的大鼠肝癌病变过程中,可以显著提高肝组织相关解毒代谢酶UGT及AKR7A的表达水平,以增强机体自身对真菌毒素的解毒能力。6.银杏叶提取物在AFB1诱发的大鼠肝癌病变过程中,能够下调GST-Pi的表达水平,可能与GST-Pi启动子区的甲基化现象有关。7.银杏叶提取物在AFB1诱发的大鼠肝癌病变过程中,p16Ink4a蛋白与p75NTR蛋白的表达呈正相关关系,提示银杏叶提取物可通过同时调节不同的基因即阻滞了细胞周期,又诱导了相应肿瘤细胞的凋亡,这可能是其抗癌机制之一。