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目的:糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病的微血管并发症,可导致不可逆的视网膜损伤。由于全球2型糖尿病的人数不断增加,导致DR人数也逐年增多,给个人和社会带来巨大的经济负担。糖尿病患者病程长和血糖控制不良是DR进展的主要危险因素。视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,HREC）是血视网膜内屏障的主要组成部分,在防止物质渗入视网膜血管和维持视网膜功能方面发挥重要作用。长期的高血糖可引起HREC损伤,导致视网膜血管通透性增加、有害物质渗漏和毛细血管变性,最终导致视网膜缺血、缺氧和新生血管的形成,由此可见,视网膜血管内皮细胞功能失调是DR重要的发病机制。m6A修饰（N6-methyladnosine）是发生在腺苷酸第六位的甲基化修饰,是真核生物中最常见和最丰富的表观遗传修饰之一,参与多种细胞生物学过程的调控。m6A修饰在转录后水平发挥作用,可以调控m RNA的剪接、出核、稳定性和翻译等过程。ALKBH5是m6A去甲基化酶,介导m6A修饰的去甲基化过程。ALKBH5通过去甲基化修饰参了多种疾病的发生发展,如多种类型肿瘤、生殖系统疾病、心肌系统疾病、成骨分化等。但是,ALKBH5在DR中的作用和机制尚不清楚。本研究首先证明ALKBH5在糖尿病大鼠视网膜和高糖刺激后的视网膜血管内皮中的异常表达。然后,构建了ALKBH5敲减和过表达的稳定细胞株,研究ALKBH5对HREC增殖、凋亡和炎症等表型的影响。进一步通过高通量测序技术探讨ALKBH5在DR中的具体调控机制,为DR的治疗提供新的思路。研究方法:1.本研究使用30m M葡萄糖刺激HREC作为DR的体外模型,STZ诱导SD大鼠糖尿病作为DR的体内模型;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光等实验方法检测ALKBH5的表达和定位。2.利用慢病毒在HREC中构建ALKBH5敲减和过表达的稳转细胞株,通过CCK8、流式细胞术、LDH、Western blot等实验手段检测ALKBH5对HREC增殖、凋亡和炎症的影响。3.本研究通过RNA-seq和RIP-seq测序技术,筛选ALKBH5调控的靶基因。应用Me-RIP-q PCR和双荧光素酶报告基因实验验证ALKBH5介导去甲基化作用调控SOX4的表达。通过Ed U、ELISA、流式细胞术等实验验证ALKBH5通过SOX4对HREC增殖、凋亡以及炎症的影响。4.应用RT-q PCR、RTPCR实验研究ALKBH5对VEGFA的影响。结果:1.ALKBH5在高糖刺激的HREC以及糖尿病大鼠视网膜中表达升高,ALKBH5在HREC的细胞核和细胞质中均有表达。2.ALKBH5敲减后可以提高HREC的m6A修饰水平和细胞活力、减少细胞凋亡和焦亡相关炎症因子的表达;ALKBH5过表达后降低了HREC的m6A修饰水平和细胞活力、增加细胞凋亡和焦亡相关炎症因子的表达,说明ALKBH5可以调节HREC的功能。3.根据RNA-seq数据发现,在ALKBH5敲减后,822个基因表达下调,664个基因表达上调。RIP-seq数据结果显示,1546个基因发生变化。联合分析两个测序数据结果筛选出6个（SOX4、HR、MST1、HSF4、TRANK1、FDNC1）ALKBH5调控的候选靶基因。检索各基因功能和作用机制后发现SOX4是糖尿病的易感基因并受m6A修饰的调控。进一步实验研究发现ALKBH5可以作用于SOX4的3’非翻译区;敲减ALKBH5后SOX4 m RNA的m6A修饰水平提高,SOX4的相对半衰期缩短,敲减YTHDF2后,SOX4 m RNA和蛋白水平表达相对升高。4.ALKBH5下调后,VEGFA-total、VEGFA-121、VEGFA-165、VEGFA-189m RNA相对表达水平降低。结论:1.本研究发现在高糖培养的HREC以及糖尿病大鼠视网膜中,ALKBH5的表达上调且与DR严重程度成正相关。2.敲减ALKBH5后提高HREC的m6A修饰水平;缓解高糖导致的HREC损伤,包括提高细胞增殖能力,抑制细胞凋亡,缓解焦亡相关炎症;相反,过表达ALKBH5后降低HREC的m6A修饰水平,促进高糖导致的HREC损伤,包括抑制细胞增殖能力,促进细胞凋亡,加重焦亡相关炎症。3.ALKBH5通过YTHDF2途径发挥去甲基化作用调控SOX4的表达促进HREC的增殖、凋亡和炎症反应。4.在DR中,下调ALKBH5可以抑制VEGFA及其可变剪接的表达。