论文部分内容阅读
H9N2亚型低致病性禽流感（Avian influenza,AI）在我国多地流行,家禽感染低致病性AIV后,其饲料转换比低下,禽类免疫力降低,蛋鸡产蛋率下降,甚至产生全身性的继发疾病,有的表现非典型的临床症状,因此对我国的养禽业造成了惨重损失。H9N2亚型低致病性禽流感易与高致病性禽流感易交换致病基因,发生基因重组,形成新型流感病毒,对人类公共卫生健康产生了巨大负面影响,所以对低致病性禽流感的检测技术成熟已刻不容缓。本论文以H9N2亚型禽流感A/chicken/Shandong/LY1/2017（119）分离株的HA基因片段为靶基因,建立了一种检测H9N2亚型禽流感病毒的绝对荧光定量PCR方法,而且证实了真核表达法氏囊源前体蛋白CBL能够抑制H9N2亚型禽流感病毒感染,同时对细胞骨架Vimentin波形蛋白对于H9N2亚型流感病毒入侵MDCK细胞的机制进行了初步探究,为后期H9N2亚型禽流感病毒的研究提供了重要的实验研究依据。1 H9N2亚型禽流感病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立本研究以H9N2亚型禽流感分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017（H9）的HA基因为模板,设计并合成SYBR Green Ⅰ特异性引物和HA基因片段引物,提取H9N2亚型禽流感山东分离株的病毒总RNA,反转录为模板cDNA,然后根据HA基因片段引物进行PCR扩增一段880bp的碱基序列,克隆至pMD-19T载体中。经过测序分析,与HA基因片段同源性达到99%,结果PCR扩增出HA基因片段,NCBI同源性比对为99%。成功构建重组载体的大肠杆菌后,提取pMD-19T-HA阳性质粒作为标准品,根据质粒浓度计算出该标准品的拷贝数,梯度稀释标准品从1×108～1×101copies/μL,以稀释的标准品为模板进行荧光定量PCR试验,构建标准曲线,结果显示在1×107～1×102 copies/μL之间Ct值和拷贝数呈现良好的线性关系,相关系数R=0.994,敏感性评价说明其检测的病毒含量最低为100 copies/μL,比普通PCR敏感度提升103倍,特异性实验扩增H9N2亚型,H5N1亚型、H7N3亚型禽流感分离株,对H5N1亚型、H7N3亚型没有特异性扩增,只能扩增H9N2亚型野毒株,其特异性好,重复性试验的变异系数CV%小于1%,重复性良好。2真核蛋白CBL抑制H9N2亚型禽流感病毒复制并抑制细胞凋亡CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在免疫调控、信号传导调节和对多种刺激的反应中起重要作用。本研究的主要目的是探讨真核表达的CBL蛋白对H9N2禽流感病毒增殖及感染细胞的凋亡情况的影响。荧光显微镜下观察真核表达重组载体EGFP-CBL在MDCK细胞内正常表达,而且qPCR结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞内病毒滴度明减少。Western Blot结果证实禽流感病毒H9N2亚型感染的转染EGFP-CBL重组载体的MDCK细胞36h,其凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值较大。流式结果显示转染EGFP-CBL重组载体的MDCK的早期凋亡细胞的比例少,显示CBL蛋白能够一定程度上抑制MDCK的凋亡。该结果表明CBL蛋白能在一定程度上抑制H9N2禽流感病毒在MDCK细胞的扩增,并且抑制细胞的凋亡,为深入研究CBL蛋白抗病毒机制提供了重要的实验依据。3细胞骨架蛋白Vimentin为H9N2亚型流感病毒入侵MDCK细胞的受体之一波形蛋白为细胞骨架蛋白,与胞内微管蛋白、肌动蛋白和动力蛋白共同作用参与细胞内吞和物质运输过程,广泛存在于各种胞核、胞质和细胞器中,微管、肌动蛋白微细丝等结合组成细胞骨架结构。在这项研究中,我们首先通过病毒与受体蛋白结合实验（VOPBA）试验,提取MDCK细胞的总蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转移到PVDF膜上,再用MOI=1pfu/cell的病毒液进行封闭,随后采用病毒一抗二抗封闭处理后,曝光得到两条结合条带,SDS-PAGE平行实验的凝胶经考马斯染色,将与曝光条带相同大小的两条条带切胶回收,带送至公司蛋白质谱测序,为Vimentin蛋白。将100μg/mL Vimentin蛋白一抗孵育MDCK细胞表面,封闭其表面Vimentin受体,接种病毒36h后进行病毒含量检测。结果表明,Vimentin蛋白表面受体封闭后,H9N2亚型流感病毒含量明显降低。接着采用siRNA实验对胞内Vimentin蛋白进行干扰,减少胞内Vimentin蛋白的合成量,接毒36h后,Western Blot结果显示Vimentin蛋白干扰成功,干扰效率大于60%,而且qPCR结果显示,相对于Control-siRNA组,Vimentin蛋白干扰组的病毒含量明显减少。随后,构建pcDNA3.0-Vimentin真核表达载体,将Vimentin蛋白在胞内过表达,验证Vimentin蛋白过量表达对于H9N2亚型流感病毒在MDCK细胞内的复制情况。WB结果显示Vimentin蛋白表达成功,且qPCR结果显示pcDNA3.0-Vimentin组的病毒含量较pcDNA3.0空载体组要高,说明Vimentin蛋白有助于H9N2亚型禽流感病毒在细胞内的复制。结果显示Vimentin波形蛋白作为胞内蛋白,Vimentin波形蛋白是影响H9N2亚型禽流感病毒入侵细胞的重要蛋白之一,且Vimentin蛋白对于流感病毒在细胞的复制也有着重要作用。