人类对脑知之甚少,理解大脑运作的机理将帮助攻克脑疾病,推动类脑人工智能等新兴产业的发展。大脑结构是实现各种脑功能的物质基础,而神经元作为其基本单元通过各种局部和跨越多个脑区甚至覆盖全脑的连接形成网络,从而实现特定的脑功能,因此在单细胞水平刻画大脑结构是理解大脑运作机理的基础性工作。猕猴作为非人灵长类动物,与人类大脑有着高度的相似性,相比较于目前常用的啮齿类实验动物在高级脑功能和精神类疾病的研究中具有不可替代的地位。然而,猕猴脑体积约是小鼠的200倍,尚缺乏有效的方法实现猕猴全脑范围的单细胞分辨水平成像。面对这一重大科学需求,本文独辟蹊径地提出了对猴脑进行光透明处理结合组织切片与光学显微成像方案。发展了一种在线光透明的新方法,在切削的同时在线对猕猴脑样本进行光透明处理,提高宽场大体积成像系统的成像效率,采用高效的琼脂糖包埋方案,将组织的超薄切片这种切片方式替换为一定厚度的振动切片,降低了对大面积组织高精度机械切片的要求,初步实现了猕猴脑样本单细胞分辨率的光学成像。本文在对比分析了已有光透明方法的基础上,确定了基于被动浸泡的水溶性试剂作为在线光透明方案,建立了快速光透明渗透模型,研究了快速光透明所需要的试剂特性,对比了不同试剂饱和溶液的快速光透明效果。实验验证并分析了山梨醇、蔗糖、果糖、甘油的快速光透明效果,发现果糖的光透明效果明显优于其他试剂,因此选用其作为快速光透明剂的主要成分。在果糖溶液中加入尿素进一步优化溶液的折射率,利用尿素与生物组织发生的水化反应产生的样本膨胀抵消生物样本因脱水而产生的部分收缩,实验表明脑组织整体的形变量控制在5%。实验验证了筛选的透明试剂对样本中荧光蛋白的亮度影响不显著。利用琼脂糖包埋的鼠脑样本验证在线光透明方法的有效性。采用以结构光显微镜结合振动切片的技术方案,实现了完整鼠脑数据的自动化获取。由于溶液粘稠度的变化,本文通过优化了振动切片的参数,实现了切削后样本表面平整度控制在10μm以内。为了纠正因光透明导致样本形变引起的相邻层数据失配问题,提出以被标记细胞为特征点的光透明图像配准方法,实现了在线光透明数据的三维准确配位。对鼠脑全脑成像的结果表明,在线光透明方法无需前期的样本透明处理,且不需要超薄切片,系统成像效率提高了一倍。为了将该方法应用于体积更大的猕猴脑样本,本文进一步优化了在线光透明的试剂配方。研究了快速光透明试剂的长时间稳定性,发现氧化反应是其透明效果减弱的主要原因之一。实验研究发现添加1-巯基甘油可以抑制快速光透明试剂的氧化还原反应,该措施提高了猕猴脑成像所需快速光透明溶液的长期稳定性。此外,针对快速光透明试剂的饱和溶液在猕猴脑块长时间成像过程中发生结晶现象,提出降低溶液浓度并添加促渗剂,作为猕猴脑快速光透明试剂的主要成分。最终,筛选出以30%果糖+20%尿素溶液+5%丙二醇+0.5%1-硫代甘油溶液作为改良后的快速光透明试剂,并优化了配套的三维大体积成像方案。该方法还可以兼容在线碘化丙啶染色以同步获取细胞构筑信息,最终耗时约10天实现了对30×30×20 mm3大小的猕猴脑块的三维成像,获取了荧光标记的神经元细胞分布与共定位的细胞构筑信息。该方法有望为猕猴甚至人脑等大体积样本的全脑范围精细结构研究提供一种全新的途径。