骨组织工程的兴起和快速发展为治疗骨缺损提供了新的思路和手段。在种子细胞和细胞载体材料的研究取得了一定的成果的基础上，已经可以在体外成功的将种子细胞复合在载体材料上培养，构建出细胞型组织工程人工骨。并应用在体外构建出的细胞型组织工程人工骨进行修复骨缺损的实验研究。研究发现，组织工程骨也面临迅速血管化的关键问题。同其它类型移植骨一样，充分的血液供应是保证组织工程化人工骨体内存活的决定性因素。如何在构建组织工程人工骨的同时重建其血液供应成为骨组织工程从体外研究过度到体内研究，从基础研究向临床应用过渡的关键性问题。本课题针对组织工程的构建和血管化做了以下五项研究： 一、骨组织工程种子细胞—骨髓来源成骨细胞的体外培养及成骨特性观察 目的 探索兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells BMSCs)在体外诱导为成骨细胞的成骨特性，为骨组织工程提供理想的种子细胞。 方法 抽取兔骨髓，通过离心法获取单个核细胞，在体外经条件培养基培养30天，观察并检测成骨细胞的生物学特性。 结果 BMSCs可在成骨条件培养液下诱导为成骨细胞，经鉴定碱性磷酸酶和矿化结节染色阳性。 结论 骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞，有希望成为理想的种子细胞应用于临床。 二、组织工程骨血管化种子细胞—兔肾微血管内皮细胞体外培养及其细胞表型的初步研究 目的 探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法，并对其进行鉴定和表型研究，拟为骨组织工程血管化提供理想的种子细胞。 方法 采用三步梯度筛网法，先获得较高纯度的肾血管球，再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞。进一步对肾微血管内皮细胞进行免疫组化法的Ⅷ因子相关抗原鉴定，用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体，以及采用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44表达。纳米级细胞型组织l_程骨的构建及其血管化的实验研究中文提要 结果体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了23代。此外，免疫组化显示姗因子相关抗原阳性，电镜下观察到W七ibel一Palade小体，以及间接免疫荧光检出CD31、CD34表达阳性，而CD44阴性。 结论本实验方法可成功培养出肾微血管内皮细胞，且后者表达CD31、CD34细!泡表型。 三、成骨细胞和血管内皮细胞体外协同培养的生物学特性观察 目的通过血管内皮细胞与成骨细胞体外协同培养，探讨两种细胞协同培养时生物学特性的相互影响。 方法用兔骨髓来源的成骨细胞和兔肾微血管内皮细胞采取直接和间接协同培养的方法倒置相差显微镜下观察细胞一般形态，细胞计数比较增殖能力，检测碱性磷酸酶(ALP)活性，研究成骨细胞成骨能力的改变。 结果在直接和间接两种协同培养条件下，BMSCs细胞诱导的成骨细胞体外培养与兔肾微血管内皮细胞具有良好的相容性，血管内皮细胞可促进成骨细胞的增殖和分化，并促进碱性磷酸酶(ALP)的分泌，同时提高成骨细胞的成骨能力;成骨细胞也能J促进血管内皮细胞的增殖和生长。 结论体外协同培养血管内皮细胞和成骨细胞，两种细胞能互相促进分化和增殖，并提高功能表达。 四、纳米级细胞型组织工程人工骨的构建—即纳米相轻基琪灰石胶原复合材料与人骨位基质干细胞体外相容性的研究 目的探讨纳米相轻基磷灰石胶原复合材料(nano一HAP/c ollagen，NHAc)与人骨髓基质干细胞(rBMSC)的相容性，为体外构建纳米级细胞型组织工程人工骨提供依据。 方法将人骨髓基质干细胞与纳米相经基磷灰石胶原复合材料体外复合培养，进行形态学和功能测定。 结果骨髓基质干细胞能在纳米相轻基磷灰石胶原复合材料上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米相轻基磷灰石胶原复合材料的影响。 结论纳米相轻基磷灰石胶原复合材料具有良好的细胞相容性，可作为骨组织工程理想的骨替代材料。纳米级细胞型组织!_程骨的构建及其血管化的实验研究中文提要 五、血管化纳米级细胞型组织工程骨修复骨缺损的动物实验研究。 目的探讨血管化纳米级细胞型组织工程人_〔骨修复骨缺损过程中血管的生成情祝，以及新生血.管和成骨的关系，为临床治疗骨缺损提供理想的人工骨。 方法应用血管内皮细胞+纳米级细胞型组织工程骨的方式将人工骨血管化，然后植入兔体内修复挠骨骨缺损，通过墨汁灌注法，组织学切片以及X线检测，观察新生血管的情况和骨愈合的情况。并以未血管化的纳米级细胞型组织工程人工骨作为对照组。 结果l，观察到血管化人工骨组的新生血管比对照组生成的要多。2，两组人工骨均能有效的修复骨缺损，但血管化人工骨组的骨愈合情况要优于对照组。 结论1，血管内皮细胞+人工骨是有效的体外将人工骨血管化的手段;2，纳米级羚基磷灰石胶原载体材料是适宜的细胞外基质载体材料:3，人工骨血管化后能明显促进骨愈合。