皮肤是人体最大的器官,它由源于外胚层的表皮及源于中胚层真皮组成。皮肤调节人体的体温,维持体液平衡,并且保护人体免遭各种物理、生物及外界环境的损害。皮肤健康人体皮肤完整性的维持有赖于表皮干细胞(ESC)的自我更新、增殖以及分化。表皮干细胞不仅对皮肤的维持有重要的作用而且对皮肤伤后的修复有重要作用。目前对于诸如严重的大面积烧伤等疾病所造成的皮肤损害的治疗对外科医生仍然是个巨大的挑战。理想状况下,这种创面应有全厚皮片或者皮瓣覆盖。然而在这些病例中,较难获得大量的供体组织。干细胞治疗是一种新兴的治疗方法,它通过体外细胞培养来修复甚至替代缺损组织。应用这种方法治疗皮肤缺损能够避免皮肤移植过程中对供区造成的额外损伤,同时所修复的面积也不受供区的限制。表皮干细胞是组织工程化皮肤的“种子细胞”,但是由于自体表皮干细胞的来源数量少,体外培养中细胞的大量扩增是一个关键性的难题,这就阻碍了组织工程化皮肤的临床应用。细胞生长因子是指具有调控细胞生长、发育的一类生物活性物质,它们免疫细胞及非免疫细胞产生,它们通过自分泌和旁分泌方式调节各种细胞的增殖和分化,多种生长因子已被证明对干细胞的体外培养有作用。本实验通过往培养基中的分别添加bFGF、IGF-1及TGFa来改变ESC生长的微环境从而影响细胞的增值及表型的维持,以期为进一步研究表皮干细胞体外大量扩增打下基础。方法材料：皮肤取自南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科16～22岁行包皮环切术患者,患者无泌尿系统感染等疾病。患者均知情同意。实验方法第一部分1.表皮干细胞的分离、培养：取得的新鲜包皮进行漂洗后修剪成1cm×1cm大小皮片,应用两步酶法分离、消化,终止消化后用200细胞筛过滤,获得细胞经Ⅳ型胶原筛选后于培养瓶中培养；2.培养细胞的鉴定(Ck19单抗,β1整合素单抗)：取生长良好的细胞进行细胞爬片,细胞生长达到适当的密度时,按照博士德ABC免疫组化染色试剂盒说明对细胞进行免疫组化染色,DAB显色；3.将IGF-1、bFGF及TGF α分别各自按浓度分为A组、B组及C组；相应各自添加细胞因子Ong/ml、10ng/ml及20ng/ml,5天后用MTT法测定波长490nm下吸光度A值。第二部分1.将表皮干细胞分为A组(K-SFM)、B组(K-SFM+10ng/ml bFGF)、C组(K-SFM+1Ong/ml IGF-1)及D组(K-SFM+10ng/ml TGF α)进行培养；2.细胞生长曲线测定：将表皮干细胞以2×103密度接种于96孔板中,分别加入相应的培养基,用MTT法测定波长490nm下吸光度,计算平均值,连续计数7d；3.细胞克隆形成率的测定：按200个/孔将细胞接种至24孔板中,分成A-E组加入相应培养基培养,培养1周后,记录克隆数；4.细胞增殖的测定：用CCK-8检测(参考CCK-8试剂盒说明书)观察培养第5d的细胞增殖(每不同细胞因子每次测定6孔)情况；5.细胞周期分析：0.25%胰酶,0.02%EDTA消化,制备细胞悬液；PBS洗涤2次,70%乙醇4℃固定过夜,用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果第一部分1.应用两步酶消化及Ⅳ型胶原筛选的方法能够较好地获得表皮干细胞；2.免疫组化观察结果：β1整合素、CK19免疫细胞化学染色显示培养细胞的胞浆内出现棕黄色的阳性表达；3.三种细胞因子作用于细胞后检测A值均升高,但并不是细胞因子浓度越大效果越好,10ng/ml及20ng/ml间无统计学差异(P>0.05)第二部分1.四组细胞的生长曲线均呈倒“S”形,细胞在第5天进入倍增期,没添加细胞因子组ESC在第9天达到高峰,而所有添加细胞因子ESC组在第11天时进入平台期；2.B、C及D组细胞克隆率明显高于A组(P<0.05),而D组高于B组及C组,差异有统计学意义(P<0.05)(A:10.0±0.71％,B:14.0±0.89％,C:13.7±0.61％,D:16.4±0.92％):3.B、C及D组吸光度A值均明显高于A组(P<0.05),而D组高于B组及C组(P<0.05),B组及C组之间差异无统计学意义(P<0.05)(A:0.502±0.006,B:0.603±0.013,C:0.584±0.015,D:0.677±0.027);4.B组及C组G0/G1细胞比例明显高于A组及D组(P<0.05),而B组与C组之间及A组与D组之间无明显差异(P<0.05)(A:55.6±2.1,B:62.8±2.4,C:63.3±2.3,D:56.0±1.0)结论1.两步酶消化法可以较好地获得表皮干细胞并且Ckl9单抗, β1整合素单抗染色均呈阳性；2.bFGF.IGF.1及TGFα均能促进表皮干细胞的增殖,且培养液中此三种细胞因子的最适浓度均为10ng/ml；3.bFGF及IGF-1对表皮干细胞表型的维持效果明显。