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Th17细胞是一类新型的辅助性T细胞,大量的研究表明它在哺乳动物免疫系统中发挥着重要的作用。它是由CD4+T细胞在受到外界刺激激活后,在细胞因子TGF-?,IL-6,IL-1?,IL-21和IL-23等的诱导下分化而来,这类细胞特征性地表达细胞因子IL-17A与IL-17F,参与其中的关键分子包括转录因子ROR?t与ROR?,以及信号分子STAT3。 相对于哺乳动物中的深入研究,硬骨鱼中Th17细胞还未定义,主要因为相关细胞因子、转录因子和信号分子等尚不明确。本论文以草鱼为研究模型,对其IL-17家族成员(IL-17A/F1、IL-17A/F2与IL-17D)、孤儿受体(ROR?1/2与ROR?1/2)、信号分子STAT3以及细胞因子IL-6与IL-23进行了分子和功能鉴定。研究内容如下: 1.草鱼IL-17家族成员的分子与功能鉴定研究:(1)利用简并聚合PCR,RACE等技术获得了草鱼中IL-17A/F1、IL-17A/F2与IL-17D的cDNA全序列,并通过保守氨基酸残基分析、多序列比对、系统进化分析证明了所获得的基因为哺乳动物中对应的同源基因。(2)通过实时荧光定量PCR检测上述三个基因在免疫刺激剂处理草鱼免疫细胞与嗜水气单胞杆菌活体感染草鱼后的头肾中的 mRNA表达变化,证明了草鱼中这三个IL-17家族成员参与了机体的免疫反应。(3)通过重组表达、蛋白质变复性、亲和纯化、超滤等方法获得了草鱼 IL-17A/F1、IL-17A/F2和IL-17D的重组蛋白,并通过对各个重组蛋白的活性验证与功能分析,发现它们均能调控炎症因子IL-1?,TNF-?的基因表达,提示这三个基因在脊椎动物中功能的保守性,其中IL-17D在调控下游基因CXCL-8表达的分子机制与哺乳动物相似。 2.草鱼孤儿受体ROR?1、ROR?2、ROR?1与ROR?2的分离鉴定与功能分析:(1)通过基因克隆分离了草鱼ROR?与ROR?的两个旁系同源物的cDNA全序列,通过多序列比对与系统进化分析论述了上述草鱼四个基因与其他物种中同源基因的进化关系。(2)通过对ROR?1、ROR?2、ROR?1与ROR?2在各个组织中的表达分析发现它们都在一些免疫和内分泌相关组织中高表达。(3)通过体内与体外实验证明了ROR?1、ROR?2、ROR?1与ROR?2参与了硬骨鱼的免疫反应。(4)为了研究硬骨鱼中ROR?/?与IL-17A/F的关系,ROR???的抑制实验证实外周血淋巴细胞中PHA对IL-17A/F1与IL-17A/F2 mRNA的上调作用依赖于ROR???的调节。(5)通过基因组步移技术获得了IL-17A/F1的启动子序列,通过软件预测其启动子上的反应元件,发现IL-17A/F1的启动上含有ROR的反应元件,支持硬骨鱼中IL-17A/F的诱导表达可能依赖于ROR???的假设。 3.草鱼信号传导与转录活化因子STAT3剪切体的分离鉴定与功能研究:(1)通过简并PCR技术获得草鱼STAT3的cDNA部分序列,接着通过RACE技术获得了STAT3四个剪切体的cDNA全序列,利用数据库Genbank和分子克隆方法发现其它硬骨鱼中同样存在四种类似的STAT3剪切异构体。(2)通过实时荧光定量PCR与蛋白质免疫印迹技术发现了在实验中选择的组织中STAT3?1/2为主要表达的剪切体,同时能被免疫刺激剂激活并发生磷酸化。(3)通过分别构建 STAT3四个剪切体与eGFP的融合表达质粒,经过表达的v-Src激活,证明这四个剪切体被激活后进入到细胞核内。(4)报告基因表达实验证明 STAT3?1与 STAT3?2在IL-10诱导SOCS3表达过程中具有转录活性,同时STAT3?1与STAT3?2则没有转录活性,甚至能抑制 STAT3?1/2的转录活性。(5)蛋白质免疫印迹技术发现当草鱼CIK细胞受到胞外信号IL-10的激活后,STAT3?1与STAT3?2影响STAT3?1与STAT3?2的磷酸化水平,说明STAT3?1/2可能通过影响STAT3?1/2的激活状态并作为STAT3?1/2的调节因子。(6)通过对斑马鱼中STAT3基因结构分析,发现硬骨鱼中STAT3的选择性剪切机制与哺乳动物中的不同。(7)通过抑制实验证明了在外周血淋巴细胞中,PHA/LPS对IL-17AF1的诱导作用是依赖于STAT3信号通路。 4.草鱼中细胞因子IL-6与IL-23亚基的克隆与功能鉴定:(1)通过基因克隆分离得到草鱼IL-6,IL-23亚基的cDNA全序列,并通过多序列比对与系统进化分析分别论述了草鱼中IL-6、IL-23p19、IL-12p40a、IL-12p40b与IL-12p40c这五个基因与其他物种中同源基因的进化关系。(2)通过实时定量PCR对上述基因的组织分布进行了研究,发现这些基因均在免疫相关组织中表达。(3)通过体外刺激细胞与体内感染的手段实验证明了它们参与了机体的免疫反应。(4)通过重组表达获得了草鱼的IL-6的重组蛋白,并证明重组的IL-6蛋白具有生物学活性。成功获得分别表达三种不同亚基组成的 IL-23的酵母阳性克隆,为后续研究硬骨鱼中IL-6和IL-23对IL-17A/F的诱导表达提供了基础。