树突状细胞(Dendritic cell, DC)是专职的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC),可以诱发特异的抗病原体和肿瘤细胞的免疫反应。不成熟的DC位于组织和周围淋巴器官,监视和识别外源性和内源性抗原,并通过吞噬、微吞饮和胞吞作用获取抗原。摄取抗原后,不成熟的DC会发生一些列的变化,包括上调细胞表面MHC II、共刺激分子及趋化因子受体的表达、增加细胞因子的分泌、细胞突起增多,并且向周围淋巴器官迁移。在引流淋巴器官中,负载抗原的DC可以通过MHC II-抗原肽-TCR复合物活化初始状态的T细胞,并且通过特异的配体表达及细胞因子的分泌活化B细胞和NK细胞。DC在抗肿瘤免疫中也发挥了极其重要的作用。DC被认为是可以产生有效抗肿瘤免疫反应的非常有前景的生物药物,因为其可以大量获得且可以在体外通过许多不同途径促进其成熟,并被运送到淋巴结以活化能够特异杀伤肿瘤细胞的T细胞。虽然在一部分小鼠荷瘤模型中DC疫苗的应用产生了极其有效的抗肿瘤免疫反应,但是,在对人前列腺癌和黑色素瘤的三期临床试验中却遭遇失败。因此,关于调节DC成熟活化分子机制的进一步研究和理解对DC的抗肿瘤免疫治疗非常必要。Notch信号是进化过程中高度保守的信号通路之一,胚胎期和出生后期在神经系统、造血系统和脉管系统等多种系统中参与了细胞命运决定、细胞增殖、分化和凋亡等过程。在哺乳动物中,Notch信号共有四个受体(Notch1-4)和五个配体(Jagged1, Jagged2, and Delta-like (Dll)1, 3, and 4)。当配体与受体结合后,Notch受体胞内段(NIC)随即转位入核,与转录因子RBP-J相互作用,去除其对基因转录的抑制作用,并且募集多种蛋白形成转录共激活物,以活化并调控下游靶基因的转录表达。Notch信号在免疫系统的发育过程中同样发挥了重要作用,包括调控T细胞、B细胞、NK细胞、DC、髓系细胞的发育、免疫突触(IS)形成和Th1/Th2偏转等。在DC发育成熟过程中,不同Notch配体所产生的效应是不同的。研究报道,Dll1可以促进DC分化,而Jagged1可能抑制DC分化且促进不成熟髓样细胞聚集,但其可以促进人单核细胞来源DC的成熟。而小鼠体内Notch1下调或缺失可以显著的损伤DC分化。尽管大量文献报道Notch信号会对DC发育产生影响,但其具体机制仍有待深入研究。Wnt信号通路是一个很复杂的信号通路,在各物种之间高度保守。最初认为Wnt信号通路由β-catenin介导,在过去15年中学者们又发现了至少三条β-catenin非依赖的Wnt信号通路。在上述三条信号通路中,钙离子被认为是非常重要的第二信使。Wnt配体为分泌型糖蛋白,如Wnt1,Wnt3a,Wnt8等。Wnt受体包括十个七次跨膜的Frizzled(Fzd)受体家族和共受体LRP-5和LRP-6。当配体受体结合后,Wnt信号被活化,通过一系列复杂过程,调控靶基因转录,决定细胞增殖、存活、改变细胞命运。大量文献报道,Notch信号通路与Wnt信号通路之间存在着相互调节,而在DC发育分化过程中,Notch信号做为Wnt信号的上游信号调节Wnt信号的活化状态,两者在调节DC发育分化过程中发挥了重要作用。我们前期研究发现,RBP-J介导的Notch信号在LPS诱导的DC成熟过程中发挥了十分关键的作用。为了进一步探索Notch信号是否参与了DC介导的抗肿瘤免疫反应,我们建立了RBP-J敲除的DC和不同肿瘤细胞共注射的小鼠荷瘤模型,观察不同肿瘤在小鼠体内的生长情况,对其免疫水平进行分析,并对其机制进行探讨。明确了Notch信号缺失对DC依赖的抗肿瘤免疫功能的影响并分析了其可能的分子机制。为更加有效的进行以DC为基础的抗肿瘤免疫治疗提供了一定的实验基础和理论支持。本课题主要研究成果如下:1、肿瘤组织浸润的DC内部Notch信号发生改变。将B16黑色素瘤细胞按照5×106的数量接种于WT C57BL/6小鼠腹部皮下,对照小鼠皮下注射PBS,10d后处死小鼠,取荷瘤小鼠和对照小鼠脾脏,用磁珠阳性分选CD11c+ DC。Real-time PCR检测细胞内Notch受体(Notch1,2,3)及下游基因(HES1,5)的表达水平。结果发现,相对于对照小鼠DC,荷瘤小鼠DC内部Notch受体及下游基因的表达发生了显著改变。说明肿瘤进展对机体免疫环境的抑制可能有Notch信号的参与。2、获得条件性RBP-J敲除转基因鼠,筛选可皮下接种的肿瘤细胞系,确定肿瘤细胞接种数量和接种后观察时间。通过饲养RBP-Jflox/WT和Mx-Cre小鼠,获得了大量Mx-Cre-RBP-Jflox/WT (RBP-J-/+)和Mx-Cre-RBP-Jflox/flox (RBP-J-/-)小鼠,经poly I:C腹腔注射诱导12次后得到RBP-J敲除小鼠。经过不同肿瘤接种数量预实验,确定肿瘤细胞接种数量为5×106。预实验中一共选用了九种小鼠源性肿瘤细胞系进行WT C57BL/6小鼠皮下荷瘤实验,包括B16黑色素瘤、H22肝癌、S180骨肉瘤、LLC肺癌、L1210白血病、EL4淋巴瘤、CT26结肠癌、MFC前胃癌、EMT6乳腺癌,其中,只有前四种肿瘤细胞能在皮下成功荷瘤。同时确定了肿瘤观察时间为肿瘤皮下注射后5d开始测量,每隔一天测量一次,至17d处死小鼠进行分析。3、Notch信号缺失的DC抗肿瘤免疫功能显著下降。用磁珠分选RBP-J-/+和RBP-J-/-小鼠DC,用肿瘤抗原负载12h,然后将1×106DC与5×106肿瘤细胞混合注射于WT C57BL/6小鼠腹部皮下,观察肿瘤生长。发现含有RBP-J-/-DC的肿瘤在皮下生长速度明显快于其对照。对肿瘤组织内部浸润的免疫细胞成分进行分析发现,含有RBP-J-/-DC的肿瘤组织内部浸润的T、B、NK细胞的数量要显著低于对照。说明DC内Notch信号的缺失损伤了其抗肿瘤免疫功能,且不能有效的募集免疫细胞向肿瘤组织内部浸润。4、Notch信号缺失抑制了DC成熟、降低了其迁移能力、损伤了其对T细胞的活化能力。与RBP-J-/+ DC相比,RBP-J-/- DC的吞噬功能并没有显著改变。肿瘤抗原刺激后,RBP-J-/- DC表面MHC II、CD80、CD86的表达水平显著低于其对照。其表面趋化因子受体CCR7的表达水平显著低于对照,且其向引流淋巴结的迁移能力显著降低。在体内和体外实验均发现,其活化初始T细胞的能力减弱,其可能是由于DC-T细胞之间IS形成障碍所致。因为我们发现DC-T接触部位CTx和MHC II表达强度减弱,且DC内部T细胞侧F-actin、α-tubulin、Vinculin的极化程度显著减低。此外,体内和体外的杀伤实验表明,RBP-J-/- DC活化的CTL对肿瘤细胞的杀伤能力也显著低于对照。这些结果说明,Notch信号缺失可能通过阻碍DC成熟、降低其迁移能力和T细胞活化能力而导致其抗肿瘤免疫功能障碍。5、Notch信号缺失导致DC内Wnt受体表达下调,细胞内钙离子水平降低。我们用Real-time PCR检测了RBP-J-/+和RBP-J-/-DC Wnt受体(Fzd2,4,6,8,10)mRNA表达水平,发现,绝大多数Wnt受体在RBP-J-/-DC的表达水平显著低于对照。LPS刺激后RBP-J-/-DC内游离钙离子水平显著低于对照。提示,Notch信号缺失可能通过下调Wnt/calcium信号通路,导致DC功能受损。6、结论通过本课题研究,发现Notch信号可能参与了肿瘤进展对机体免疫系统的抑制。Notch信号敲除可以严重损伤DC在小鼠体内的抗肿瘤免疫功能,导致肿瘤组织内浸润的T、B、NK细胞数目显著降低,最终导致其不能有效抑制肿瘤生长。进一步研究发现,Notch信号缺失阻碍了肿瘤抗原刺激后DC表面MHC II、CD80、CD86的上调,降低了趋化因子受体CCR7的表达,减少了其向引流淋巴结的迁移,削弱了其与T细胞间IS的形成,减弱了其对初始T细胞的活化。深入机制研究发现,Notch信号缺失很有可能是通过下调Wnt受体Fzd家族的表达,降低了Wnt/calcium信号通路的活化水平,进而降低了DC内游离钙离子水平,最终通过影响DC内细胞骨架在DC-T接触过程中的极化而减弱DC-T细胞之间IS的形成而损伤其功能。以上结果告诉我们,Notch信号在DC依赖的抗肿瘤免疫过程中发挥了极其重要的作用,使我们对基于DC疫苗的抗肿瘤免疫治疗有了更进一步的认识。反之,提示我们DC内部Notch信号的上调可能会在一定程度上增强其抗肿瘤免疫功能,为临床上DC疫苗的应用提供了新的思路和方向。